انواع pcr
انواع PCR
انواع PCR RT-PCR: الگوي اوليه دراين روش مولكول RNA تك زنجيره اي است.ازآنجائيكه DNA پليمراز قادربه استفاده ازRNAبعنوان الگو نميباشد،مرحله ديگري به PCR اضافه شده است.طي اين مرحله با استفاده از آنزيم RT(Reverse Transcriptase) از الگويRNA ،مكملش يعني cDNA سنتز ميشودوسپس بوسيله تكنيك PCRتكثير مي يابدآنزيم نسخه بردار معكوس دراين روش ازويروس ميلوبلاستوماي مرغ (AMV) بدست مي آيد.كاربرد اين آنزيم به دليل حساس بودنش به حرارت پايين بوده ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس اين روش بهبود يافت.اين باكتري DNA پليمراز مقاوم به حرارت به نام Tthتوليد مي كندو در حضور يون منگنز داراي فعاليت نسخه برداري معكوس است و در دماي°C72 توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود.سپس منگنز اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسيد EGTA حذف ميشودواين آنزيم ازDNA اي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي كند.براي تكثير ماده ژنتيكي ويروس هاي RNAدار مثل HIV از اين روش استفاده ميشود. PCRنامتقارن( Asymmetric PCR): هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System): اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده است دو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشد در هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي ...
انواع PCR
انواع PCR PCR)Asymmetric PCRنامتقارن): هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد ARMS PCR)Amplification Refractory Mutation System): اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده استدو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشددر هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگي اگزونوكلئازي َ5َ à 3َ است،استفاده شودزيرا استفاده از يك آنزيم اصلاحگر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهاي 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو الل از بين ميرود. از اين روش در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود. Hot-Start PCR: زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شودحتي تاوقتيكه دماي لوله ها تا°C70-°C65 افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي وبهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر،استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن فيزيكي مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از °C70 از واكنش جدا مي شود و ...
انواع PCR
انواع PCR PCR)Asymmetric PCRنامتقارن): هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد ARMS PCR)Amplification Refractory Mutation System): اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده استدو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشددر هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگي اگزونوكلئازي َ5َ à 3َ است،استفاده شودزيرا استفاده از يك آنزيم اصلاحگر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهاي 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو الل از بين ميرود. از اين روش در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود. Hot-Start PCR: زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شودحتي تاوقتيكه دماي لوله ها تا°C70-°C65 افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي وبهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر،استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن فيزيكي مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از °C70 از واكنش جدا مي شود و ...
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت n2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید. امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید. PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد. محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است: ۱٫ DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد. ۲٫ پرایمرهای Forward و Reverse: ...
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال 1993 به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید. PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر 10 کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد. محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است: 1. DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد. 2. پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ3 در یکی از رشته های DNA باشد. 3. Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود 70 درجه سانتیگراد باشد. 4. دزوکسی نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند. 5. محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود. 6. کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز 7. کاتیون یک ظرفیتی: یون پتاسیم محلولPCR معمولا به حجم 10 تا 200 میکرولیتر در لوله های کوچک 0.2 تا 0.5 میلی لیتر تهیه میشود. این لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند. ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود. در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین 20 تا 40 بار تکرار میشود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود. دمای لوله ها و فواصل زمانی هم تابع عوامل مختلفی است از جمله: نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها. مراحل PCR: 1. مرحله شروع (Initialization step): به مدت 1 تا 9 دقیقه دمای محلول به 94 تا 96 درجه (یا 98 درجه اگر پلیمرازها کاملا به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روشhot-start PCR هستند. 2. مرحله واسرشت (Denaturation step): این مرحله اولین قسمت ...
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت n2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید. امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید. PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد. محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است: ۱٫ DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد. ۲٫ پرایمرهای Forward ...
میکروب
سوال:تجسس کدام قطعه ژنتیکی برای تعیین ژنوتیپ مایکوباکتریوم توبرکلوزیس رایج است؟ الف: rRNA16s ب: Tn 1546 ج:IS 6110 د: Tn 9 پاسخ گزینه ج کپی های متعددی از قطعه الحاقی 6110 (IS 6110) در کروموزوم اغلب سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس وجود دارد و معمولا محل قرارگیری آن مختلف است. منبع یک : جاوتز انتشارات اندیشه رفیع صفحه ۳۶۸ منبع ۲ : درسنامه جامع میکروبشناسی تالیف : موسی بهری در کدامیک از موارد زیر دوبار PCR انجام می شود؟ الف: Multiplex PCR ب:RT PCR ج:FRLP PCR د:Nasted PCR پاسخ گزینه د انواع PCR RT-PCR: الگوي اوليه دراين روش مولكول RNA تك زنجيره اي است.ازآنجائيكه DNA پليمراز قادربه استفاده ازRNAبعنوان الگو نميباشد،مرحله ديگري به PCR اضافه شده است.طي اين مرحله با استفاده از آنزيم RT(Reverse Transcriptase) از الگويRNA ،مكملش يعني cDNA سنتز ميشودوسپس بوسيله تكنيك PCRتكثير مي يابدآنزيم نسخه بردار معكوس دراين روش ازويروس ميلوبلاستوماي مرغ (AMV) بدست مي آيد.كاربرد اين آنزيم به دليل حساس بودنش به حرارت پايين بوده ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس اين روش بهبود يافت.اين باكتري DNA پليمراز مقاوم به حرارت به نام Tthتوليد مي كندو در حضور يون منگنز داراي فعاليت نسخه برداري معكوس است و در دماي°C72 توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود.سپس منگنز اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسيد EGTA حذف ميشودواين آنزيم ازDNA اي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي كند.براي تكثير ماده ژنتيكي ويروس هاي RNAدار مثل HIV از اين روش استفاده ميشود. PCRنامتقارن( Asymmetric PCR): هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System): اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده است دو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه ...
همه چیز درباره RT-PCR معرفی روش Real Time PCR
همه چیز درباره RT-PCR معرفی روش Real Time PCR همه چیز درباره RT-PCR همه چیز درباره rt PCR معرفی روش Real Time PCR یکی از شاخه های علم بیولوژی مطالعه Transcriptomics سلول های مختلف تحت شرایط متفاوت و بررسی میزان و نوع بیان ژن های مختلف می باشد. از روش ها و مراحل مهم در پروژه های بیولوژی ملکولی استخراج یک ملکول RNA خاص و یا کل RNA از سلول های پروکاریوتی، یوکاریوتی و یا ویروس ها می باشد. معمولاً در مرحله بعد از این ملکول های RNA استفاده شده و با بهره گیری از آنزیم Reverse Transcriptase ملکول cDNA (کتابخانه cDNA) ساخته می شود. گروه پژوهشی پیشگامان انتقال ژن (GTP) با بهره گیری از کارشناسان ماهر و متخصصین به شما کمک می کند تا در کمترین زمان RNA مورد نظر خود و یا cDNA مطلوب خود را در اختیار داشته باشید این تکنیک کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و تحقیقات دارد. در این روش میتوان یک سکانس خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونهای مورد مطالعه اندازه گیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل، غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود. سایر نامهای این تکنیک عبارتند از quantitative real time polymerase chain reaction و kinetic polymerase chain reaction. این تکنیک گاهی به اشتباه RT-PCR نامیده میشود که مخفف روش Reverse Transcription PCR است. ولی امروزه در دنیای تجارت و حتی مراکز تحقیقاتی بصورت یک اشتباه مصطلح در آمده است. گاهی روش Real-time PCR با رونویسی معکوس(reverse transcription) ادغام میگردد تا مقدار mRNA (messenger RNA) در سلولها و بافتها اندازه گیری شود. این تکنیک جدید، Real-time reverse-transcription PCR نامیده میشود و با علامتهای اختصاری qRT-PCR، RRT-PCRو یا RT-rt PCR مشخص میگردد. در تکنیک Real-time PCR، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس استفاده میشود. تعیین غلظت DNA با استفاده از رنگهای فلورسانس در این تکنیک از رنگهایی استفاده میشود که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA (double-stranded:ds)، نور فلورسانس منتشر میکنند. بنابر این در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان فلورسانس در محلول افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آید. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNAی هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه میشود. لازم به ذکر است که رنگهایی نظیر SYBR Green به تمام انواع DNAی دو رشته ای، ازجمله محصولات غیر اختصاصی PCR و حتی دیمرهای پرایمر (Primer dimers) نیز متصل میشوند و این موضوع موجب کاهش اختصاصی بودن (Specificity) در نتایج حاصل میشود. تعیین غلظت DNA با استفاده از شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس در تکنیک Real-time PCR، ...