تشخیص آزمایشگاهی عفونت دستگاه گوارش

ویبریوکلرا

"خانواده ويبريوناسه شامل باسيل‌هاي گرم منفي، خميده، متحرك و داراي يك تاژك قطبي هستند و بخاطر اكسيداز مثبت بودن، از خانواده انتروباكترياسه متمايز مي‌گردند. اين ارگانيزم‌ها در آب دريا و سطحي يافت مي‌شوند. مهمترين گونه اين خانواده ويبريوكلرا است كه عامل بيماري اسهال وبائي پاندميك و اپيدميك محسوب مي‌گردد. علامت اصلي بيماري وبا، اسهال و كم آبي شديد، توقف جريان خون كاهش ادرار بوده و مشخصه اصلي اسهال وبائي، مدفوع آب برنجي است ."

براي تشخيص بيماران مشكوك به وبا استفاده از مدفوع تازه بهتر از سواب ركتال مي باشد، اما در طي فاز حاد بيماري مي‌توان از سواب نيز استفاده كرد. اين باكتري حساس بوده و بايستي نمونه مدفوع در محيط انتقالي كري بلير (Cary Blair) جمع‌آوري و به آزمايشگاه منتقل شود. بافر سالين – گليسرول مناسب نيست زيرا گليسرول اثر سمي روي عامل وبا دارد.

براي جداسازي ويبريو از محيط‌هاي مغذي مانند آبگوشت پپتون قليايي (pH=8.4) استفاده مي‌شود. پس از تلقيح مدفوع بمدت 5 تا 8 ساعت در حرارت 35 انكوبه شده و سپس در محيط هاي كشت انتخابي و غيرانتخابي كشت مجدد مي‌شود. ويبريوكلرا در آگار خون گوسفند، شكلات، مك كانكي و نيز در آبگوشت كشت خون، تيوگليكولات و عصاره قلبي – مغزي رشد مي‌نمايد. اين باكتري در EME و SS آگار بخوبي رشد نمي‌كند. براي بدست آوردن ويبريو از نمونه مدفوعي بهتر است از محيط‌هاي انتخابي مانند TCBS (تيوسولفات سيترات بايل سالت سوكروز) آگار استفاده نمود. رنگ كلني ويبريوكلرا، در اين محيط زرد رنگ است.

(Telluride Taurocholate Gelatin) یا TTG آگار محيط انتخابي ديگري است، اما متأسفانه به شكل تجاري در دسترس نيست . آگار قليايي عصاره گوشت (MEA) و آگار نمك صفراوي، محيط كشت ارزان قيمتي نسبت به محيط TCBS آگار است كه نتايج خوبي نيز دارد. كلني‌هاي ويبريو، كروي ، محدب با سطح صاف و در تابش نور مايل كدر بوده و دانه‌دار هستند. در مك كانكي آگار كلني‌هاي بي‌رنگ توليد مي‌كنند. نمونه مناسب براي كشت، رشته‌هاي مخاطي مدفوع است. در اكثر آزمايشگاهها ركتال سواب مستقيماً بر سطح محيط‌هاي كشت آگاردار تلقيح مي‌شود. مقدار تلقيح نمونه در اين محيطها حائز اهميت است. معمولاً در محيط‌هاي كشت انتخابي سه لوپ و در محيط‌هاي ديگر يك لوپ از مدفوع كافي است. در اسميرهاي تهيه شده از مدفوع، ويبريوكلرا، نماي خاصي ندارد. ميكروسكوپ زمينه تاريك و فاز كنتر است ممكن است ويبريوهاي بسيار متحرك را آشكار سازد.

خصوصيات رشد اين باكتري عبارت است: عدم توليد گاز از گلوكز، تخمير سوكروز، عدم تخمير لاكتوز و آرابينوز، تست ليزين دكربوكيسلاز مثبت، تست اورني‌تين دكربوكسيلاز مثبت و تست دي‌هيدرولاز آرژنين منفي است. تست اكسيداز يك آزمون اساسي براي شناسائي اوليه و سريعتر ويبريوكلرا است، آزمون اكسيداز بايد در آگار خوندار يا محيطي ديگر عاري از قندهاي قابل تخمير انجام گردد و محيط مك‌كانكي آگار (بدليل لاكتوز) و TCBS (بدليل سوكروز) مناسب نبوده و بطور كاذب منفي خواهد شد . چند تست تجاري براي تعيين هويت و تأييد ويبريوها وجود دارد مانند (API 20 E. Biomerieux) ولي اين تست‌ها قابل اعتماد نبوده و بهتر است از واكنش‌هاي بيوشيميايي و آگلوتيناسيون ارگانيزم توسط آنتي‌سرم‌هاي پلي والان استفاده كرد. ويبريوكلرا حاوي ليپوپلي‌ساكاريد است كه خاصيت آنتي ژني داشته و 139 گروه آنتي ژني دارد. گروه 01 و 0139 عامل وبا مي‌باشند. گاهي ويبريوكلرا غير از گروه 01 و 0139 باعث بيماري شبه وبايي مي‌گردد. ويبريوكلرا اپيدميك دو بيوتيپ دارد به نامهاي كلاسيك (Classical) و التور (El Tor). بيوتيپ التور برخلاف كلاسيك، هموليزين توليد مي‌كند و تست وژه پروسكوئر مثبت و در برابر پلي‌ميكسين B (50 ميكروگرمي) مقاوم است و نسبت به نوع كلاسيك، بيماري خفيف‌تري ايجاد مي‌كند.

سوشهاي توليد كننده سم وبا در سر و گروه 01 را مي توان به ساب تايپ هاي اوگاوا (Ogawa)؛ اينابا (Inaba) و هيكوجيما (Hikojima) تقسيم‌بندي كرد. تمامي ويبريوكلراهاي جدا شده را بايد براي تعيين بيوتايپ و سروتايپ به آزمايشگاه رفرانس ارسال كرد .

ويبريوكلرا را مي توان بر اساس حساسيت به ماده 2 و 4- دي آمينو -6 و 7 دي ايزوپروپيل پتريدين (129/O)، از باسيل هاي گرم منفي اكسيداز مثبت مانند آئروموناسها و پلزيوموناس شيگلوئيدز متمايز كرد. ويبريوكلرا، قادر به رشد در pH بسيار بالا (5/8 تا 5/9) بوده و به سرعت در برابر اسيد كشته مي شود. ويبريوكلرا براي رشدش نيازي به نمك ندارد و قادر به رشد در حضور 6 درصد كلرور سديم نيست، بنابراين رشد در نمك 6 درصد يك مرحله كليدي براي افتراق ويبريو كلرا از ويبريوهاي هالوفيل مانند ويبريو پارا-هموليتيكوس است. از تست String مي توان براي افتراق ويبريو از آئروموناس و پلزيوموناس استفاده نمود. در اين آزمون ارگانيزم در داكسي كولات سديم 5/0 درصد امولسيفيه شده و سلول‌هاي ويبريو ليز و DNA آنها آزاد مي شود. بدين ترتيب حالت چسبناكي و ريش ريش شدن به كمك لوپ قابل مشاهده خواهد بود. توكسين وبا توسط روش ELISA و واكنش آگلوتينه شدن توكسين با آنتي توكسين قابل شناسايي است اما استفاده از اين روش معمول نبوده و اغلب در تحقيقات اپيدميولوژيكي از آن سود مي‌جويند.

در كشورهاي اندميك يك كارشناس با تجربه مي تواند به راحتي با حداقل روشهاي آزمايشگاهي از قبيل حركت در زمينه تاريك و يا آزمون استرينگ ارگانيزم را شناسايي كند اما در كشورهايي كه ابتلا به بيماري نادر است با انجام يكسري از آزمايشهاي بيوشيميايي و سرولوژيكي قابل تشخيص هستند.

ويبريو پاراهموليتيكوس از طريق غذاهاي دريايي آلوده انتقال مي‌يابد و از علل عمده اسهال در ژاپن محسوب مي گردد كه بيشتر در اثر خوردن ماهي خام است. اسهال ايجاد شده خودبخود محدود شونده مي باشد. اين باكتري اصولاً بر اساس توانايي رشد در حضور نمك طعام 6 درصد و رنگ سبز كلني در محيط TCBS آگار از ويبريوكلرا متمايز مي گردد.

كمپيلوباكتر (Campylobacter)

"اسهال ناشي از كمپيلوباكتر حداقل به اندازه سالمونلا و شيگلا شيوع دارد. اسهال كمپيلوباكتري بيشتر شبيه اسهال هاي باكتريايي (خصوصاً شيگلا) مي باشد. منبع عفونت شير، غذا، تماس با حيوانات و انسان و ترشحات آنها مي باشد. در دو سوم از موارد سبب اسهال آبكي و در يك سوم موارد باعث اسهال خوني مي شود. تب گاهي ديده مي شود و شدت اسهال كم و 2 تا 5 روز طول مي كشد. كمپيلوباكترژوژوني يك باسيل گرم منفي، سخت رشد و متحركي است كه در حرارت 25 درجه سانتيگراد رشد نمي كند. بهترين درجه حرارت رشد آن 42 درجه سانتيگراد مي باشد. براي جداسازي آن بهتر است نمونه اسهال در دو پليت در دو دماي 37 و 42 درجه سانتيگراد انكوبه شود. براي كشت كمپيلوباكتر، محيط انتخابي مانند اسكايرو (Skirrow) ، باتزلر (butzler) و كمپي باپ (Campy-BAP) لازم است. در شرايط ميكروآئروفيليك رشد آن تشديد مي شود. يك روش آسان براي جدا كردن اين باكتري از مدفوع قرار دادن پليت ها در يك جار بيهوازي و توليد گاز با كمك گاز پك مخصوص مي باشد. كلني هاي آن پس از 48 تا 72 ساعت بيرنگ يا خاكستري و كمي موكوئيدي است. اين باكتري اكسيداز و كاتالاز مثبت بوده و هيپورات را هيدروليز مي نمايد. مقاوم به سفالوتين و حساس به ناليديكسيك است، كربوهيدراتها را تخمير نكرده و H2S ايجاد نمي كند. در اسمير رنگ آميزي شده با فوشين آبكي 1 درصد و يا گرم از مدفوع، كمپيلوباكترها به اشكال ويرگول، S شكل و يا شبيه بال پرنده در حال پرواز مشاهده مي شوند. در صورت مثبت بودن اسمير اسهالي، 45 درصد و در صورت منفي بودن 99 درصد ارزش تشخيص دارد. اين باكتري در زير ميكروسكوپ زمينة تاريك يا فاز كنتراست، تحرك دارتي شكل از خود نشان مي دهد."

اشريشيا كلي (E.Coli)

"اشريشيا كلي، باسيل گرم منفي و شاخصترين عضو خانواده انتروباكترياسه است كه معمولاً گلوكز، لاكتوز، تره هالوز، و زايلوز را تخمير مي كند. اندول و متيل رد مثبت بوده و از توليد H2S، DNase، اوره‌آز و فنيل آلانين دآميناز عاجز است قادر به رشد در حضور سيانيد پتاسيم و يا استفاده از سيترات به عنوان تنها منبع كربن نيست. اغلب متحرك است و وژه پرسكوئر منفي مي باشد. اين باكتري معمولا بر روي بلاد آگار، هموليز بتا و بر روي مك كانكي آگار كلني هاي صورتي تيره با هاله كدر صورتي رنگ در اطراف كلني ها بخاطر رسوب املاح صفراوي ايجاد مي كند . اشريشيا كلي هاي مولد اسهال از لحاظ خصوصيات بيوشيميايي مشابه انواع فلور طبيعي غيرپاتوژن هستند ولي بعلت داشتن فاكتورهاي ويرولانس از آنها متمايز مي شوند. حداقل 6 تيپ از اشريشيا كلي هاي مولد اسهال شناسايي شده اند:"

1-‌EPEC : اشريشيا كلي انتروپاتوژنيك

2-‌ EHEC: اشريشيا كلي انتروهموراژيك (يا VTEC: اشريشيا كلي مولد وروتوكسين).

شيگلا (Shigella)

"شيگلاها از اعضاي خانوادة انتروباكترياسه بوده و از نظر تاكسونومي به اشريشياكلي (بويژه EIEC) بسيار نزديك هستند. گونه هاي شيگلا بويژه شيگلا ديسانتريه (S.dysenteriae) مي توانند سندرم اسهالي ايجاد نمايند كه با حضور مقادير فراواني خون و چرك در نمونة مدفوع مشخص مي گردد. شيگلوز (Shigellosis) مسري ترين فرم در بين اسهالهاي باكتريايي است ولي تهاجم عميق‌تر به ناحيه گره هاي لنفاوي يا جريان خون، شايع نيست. گونه هاي ديگر شيگلا عبارتند از: شيگلا سونه اي (S.sonnei)، شيگلا بويدئي (S.boydii)، و شيگلا فلكسنري (S.flexneri) كه ميزان شيوع آنها در كشورهاي مختلف، متفاوت است."

تشخيص آزمايشگاهي:شيگلا ها، ارگانيسم هاي حساس هستند كه در خارج از بدن ميزبان بمدت طولاني زنده نمي مانند. اين ارگانيسم ها بويژه به pH اسيدي حساس‌اند و به همين خاطر نمونه هاي مدفوعي تهيه شده از بيماران را بلافاصله بايد مورد بررسي و كشت قرار داد. نمونه هاي اسهالي مبتلايان به شيگلوز حاوي چرك و خون هستند كه نشاندهنده وجود يك عامل تهاجمي در روده است. مدفوع خوني را هر چه سريعتر، بايستي در محيط كشت مناسبي نظير آنچه كه در سالمونلا مورد استفاده است، كشت داد. اين باكتري‌ها سولفيد هيدروژن توليد نمي كنند و لذا كلني هاي بدون خال سياه در سطح محيط هاي كشت انتخابي ايجاد خواهند كرد. كلني هاي شيگلا در محيط HE آگار، به رنگ سبز، يا سبز آبي و در محيط XLD آگار بي‌رنگ يا قرمز رنگ خواهند بود.

شيگلاها باسيل هاي گرم منفي بي حركت و بدون كپسول هستند كه لاكتوز را تخمير نمي كنند (بجز شيگلا سونه اي كه اين قند را به تأني تخمير مي كند). تمامي گونه ها از تخمير قند گلوكز گاز توليد نمي كنند. ليزين دكربوكسيلاز، استات، موكات و زايلوز منفي‌اند كه بدين وسيله از اشريشياكلي ها متمايز مي گردند.

شيگلا ديسانتريه داراي 16 نوع (تايپ) آنتي ژني است كه نوع «يك» مولد توكسين شيگلاست. گونه فلكسنري به 6 نوع و 14 زير نوع (ساب تايپ) تقسيم مي شود و گونة بويدئي واجد 8 نوع سرولوژيكي و گونة سونه‌اي تنها داراي يك سروتايپ است كه با روشهاي سرولوژيكي مي توان آنها را از همديگر متمايز نمود. با تست هاي بيوشيميايي نيز مي توان برخي از گروههاي سرمي شيگلا را از بقيه تميز داد. مثلاً تنها شيگلا ديسانتريه (گروه سرمي A) است كه از تخمير قند مانيتول عاجز است. و تنها شيگلا سونه اي (گروه سرمي D) ، اورنيتين دكربوكسيلاز مثبت مي باشد .

يرسينيا انتروكوليتيكا (Yersinia enterocolitica)

"اين باكتري كه يك باسيل گرم منفي كوتاه و دوقطبي جزو خانواده انتروباكتريا است، سندرم شبيه سالمونلوز ايجاد مي كند. ارگانيسم ممكن است در شير و محصولات لبني غير پاستوريزه يافت شود و عامل رايج اسهال در مناطق سردسير است. بيماران مبتلا معمولاً داراي تب بوده و مدفوع آنها واجد گلبولهاي قرمز و سفيد خوني است. تهاجم باكتريها به گروههاي لنفاوي ممكن است منجر به ايجاد سندرم آدنيت مزانتر شود كه اين سندرم گاهي با آپانديسيت اشتباه گرفته مي شود. توانايي زنده ماندن اين ارگانيسم در دماهاي پايين يخچال، يك عامل مساعد كننده عفونت نيز محسوب مي شود كه البته از اين خصوصيت در تشخيص آزمايشگاهي باكتري نيز استفاده مي شود. از اين باكتري شش بيوتايپ و بيش از 60 سروتايپ شناسايي كرده اند كه سروتايپ هاي 0:3، 0:5,27 ، o:8 و o:9 بيش از بقيه از عفونتهاي انساني جدا مي شوند. "

تشخيص آزمايشگاهي:گونه هاي يرسينيا بخوبي در دماي 25 درجه سانتيگراد در محيط هاي كشت رايج نظير بلادآگار و مك كانكي آگار رشد مي كنند كه از اين خاصيت براي جداسازي و تشخيص آن در آزمايشگاه استفاده مي كنند، بعلاوه اين باكتري توانايي رشد و تكثير در دماي 1- تا 45 درجه سانتيگراد را دارد. با استفاده از محيط هاي كشت انتخابي نظير سفسوكودين – ايرگازان – نووبيوسين (CIN) آگار و كشت نمونه در آنها و انكوباسيون در دماي مذكور، امكان جداسازي اين باكتريها را آسان مي سازد. روش تغليظ در سرما (Cold enrichment) مانند قرار دادن. نمونه هاي مدفوع در محلول ايزوتونيك نمك (نرمال سالين) و نگهداري آنها بمدت 1 تا 3 هفته در 4 درجه سانتيگراد قبل از تلقيح نمونه به كشت انتخابي، امكان بدست آوردن ارگانيسم را بسيار افزايش مي دهد. يرسينياها از نظر توليد H2S (در TSI آگار) و تست هاي وژه پروسكوئر، سيمون سيترات، سيانيد پتاسيم، فنيل آلانين د آميناز و ليزين دكربوكسيلاز منفي اند ولي اوره آز، اندول ، متيل رد، و مانيتول مثبت اند. از طرفي يرسينيا انتروكولي تيكا، اورنيتين دكربوكسيلاز، سوكروز و سلوبيوز مثبت مي باشد كه بدين ترتيب از گونه هاي ديگر يرسينياها متمايز مي گردد. از روشهاي سرولوژيك نيز براي تشخيص اين باكتري مي توان استفاده نمود .

كلستريديوم ديفيسيل (Clostridium difficile)

"اين باكتري نوعي آنتروكوليت همراه با ايجاد غشاء كاذب در اثر تجويز آنتي بيوتيك هايي مانند كليندامايسين و لينكومايسين ايجاد مي كند. تشخيص بيماري بر مشاهده علائم اختصاصي در اندوسكوپ و مصرف قبلي آنتي‌بيوتيك همراه با نتايج آزمايشگاهي استوار مي باشد .. كلستريديوم ديفيسيل، باسيل گرم مثبت بي‌هوازي اجباري اسپوردار مي باشد كه در كشتهاي اوليه متحرك است. جهت ايزولاسيون كلستريديوم ديفيسيل از مدفوع از محيط اختصاصي CCFA (Cycloserine Cefoxitine Fructose Agar) استفاده مي شود. بدين منظور محيط كشت در شرايط بي هوازي انكوبه مي شود. كلني هاي ميكروارگانيسم بر سطح آن به رنگ زرد با جلاي قوس و قزحي مي باشد. در محيط آگار خوندار بي هوازي، كلني هاي كلستريديوم ديفيسيل، خاكستري رنگ و مات بوده و در 24 تا 48 ساعت غيرهموليتيك هستند ولي تعداد معدودي از سويه ها ممكن است توليد آلفا هموليز نمايند. بعد از 48 تا 72 ساعت انكوباسيون، كلني هاي خاكستري با مركز سفيد بوجود مي‌آيند. از طرفي رشد باكتري در محيط هاي كشت بعلت توليد بوي شديد كود اسب كه جهت شناسايي كلستريديوم ديفيسيل اختصاصي است، بايد مورد توجه قرار بگيرد. اگر باكتري در زير نور لامپ وود (نور ماوراء بنفش) داراي فلورسانس زرد – سبز بوده و آزمايش لسيتيناز (Lecithinase) و ليپاز منفي باشد مي توان آنرا بعنوان تعيين گونه اوليه گزارش نمود. شناسايي كلستريديوم ديفيسيل ايجاد كننده انتروكوليت با غشاء كاذب با اثبات توليد توكسين قطعي مي شود. براي اين منظور از تكنيك هايي مانند الايزا (ELISA) جهت شناسايي توكسين هاي A و B مي توان استفاده نمود. در اغلب آزمايشگاهها از روش آگلوتيناسيون لاتكس استفاده مي شود .

تشخیص آزمایشگاهی عفونت دستگاه گوارش

مطالب مشابه :

صفات بیوشیمیایی آنتروباكترياسه ها

معرفی خانواده انتروباکتریاسه enterobacteriacea

محیط های کشت افتراقی

محیط های کشت افتراقی

پروتئوس(انتروباکتریاسه)

عفونتهای مجاری ادراری و تشخیص آنها

تشخیص آزمایشگاهی عفونت دستگاه گوارش

همه چیز درباره شیگلا

آنزیم کاتالاز و انواع آن