صفات بیوشیمیایی آنتروباكترياسه ها

آزمایش احیای نیترات Nitrite Reduction test

آنتروباکتریاسه ها داری آنزیمی هستند به نام نیترات ردوکتاز که قادراست نیترات رابه نیتریت احیانماید

مکانیسم

باکتری در صورت احیای نیترات محصولات جدیدی مانند نیتریت اکسیدوز، نیتروزوغیره تولید می کندوباعث ازبین رفتن نیترات درمحیط می شود. اگر نیترات به نیتریت تبدیل شده باشد پس از اضافه کردن معرف اسید سولفانیلیک باعث ایجاد نیتروز اکسیدوتشکیل نمک دی آزونیوم شده واین نمک بامعرف آلفانفتیل آمین تشکیل رنگ قرمزیا بنفش محلول درآب رامی دهد

روش انجام آزمایش

محلول Aهشت گرم اسیدسولفانیلیک رادرهزارمیلی لیتراسید استیک پنج نرمال حل کنید

Bمحلول پنج گرم آلفانفتیل آمین رادر1000میلی لیتر اسید استک5 نرمال حل کنید

ارگانیسم موردنظررادرمحیط کشت مایع حاوی نیترات به مدت24ساعت کشت دهید.

2 -حجم مساوی ازمحلول1و2راباهم مخلوط کرده وسپس یک دهم میلی لیترازاین معرف رابه محیط کشت اضافه می کنیم.

ایجاد رنگ قرمزدرعرض1تا3دقیقه نشانه احیای نیترات به نیترات می باشد وتست مثبت تلقی میشود

معرف A:اسيد سولفانيليك

معرف B:آلفانفتيل آمين

Pseudomonasaeruginosa: منفي بدون تغيير

Escherichiacoli: positive : مثبت ايجاد رنك قرمز

Corynebacteriumxerosis: appears :منفي

اگررنگ قرمزایجادنشدجهت اطمینان مقدارکمی ازگرد روی به محیط کشت اضافه کنید كه آيا واقعا باكتري نتوانسته نيترات رااحيا كند يا توليدN2يا NH2 كرده ایجادرنگ قرمز دراین حالت وجود نیترات احیانشده رامشخص می کند.

ايجاد رنك قرمز دراين مرحله(اضافه كردن بودر روي ) نشانه منفي بودن تست وعدم احيائ نيترات مي باشد

کلیگرآیرون آگار

یک محیط افتراقی است که دارای قند گلوکز لاکتوز پپتون وتیوسولفات سدیم می باشد. مقدار گلوکز یک دهم لاکتوز می باشد. از این محیط جهت بررسی تخمیرقندهای گلوکز، لاکتوز ،ایجاد گازSH2 می توان بررسی کرد. این محیط دارای دو قسمت استوانه ای وشیبدار است برای آزمایش کافی است که نوک آنس نوک تیز رابه باکتری آلوده نموده ومستقیم تا4میلیمتر به انتهای لوله به داخل محیط فروببرید وازهمان جهت خارج کرده وسپس درسطح شیبدار به صورت زیگزاگ کشت دهید.لوله های کشت داده شده رادر گرمخانه37درجه سانتیگرادبه مدت 16تا18ساعت نگهداری نمایید

الف)مکانیسم شناسایی توانایی تخمیرقندهادرمحیط

دربسیاری ازباکتریها گلوکز اولین منبع انرژی مورد استفاده قرار می گیردو درصورت اتمام ازمنابع دیگراستفاده می کند

دراین محیط باکتری درصورت تخمیر قند ایجاد اسید می نماید که باعث تغییر رنگ معرف فنل ردازقرمز به زرد میدهد

دراین محیط درصورتیکه باکتری قادربه تخمیر قندها نباشدازپپتون استفاده کرده ورنگ معرف قرمز می شود لازم به ذکر است باکتریها فقط درشرایط هوازی قادربه تخمیر پپتون هستند

درصورتیکه باکتری قادربه تخمیر گلوکز باشد درسطح شیبدار واستوانه ایجاد اسید کرده ورنگ زرددر هردو قسمت ایجادمی شود پس ازچندساعت به دلیل اینکه درقسمت شیبدارباکتری بیشتری وجود دارد گلوکز تمام شده ودرصورتیکه بتواند از لاکتوز استفاده می کندرنگ محیط زردمانده که حالت اسید-اسیدگفته میشود.

درصورتیکه باکتری قادربه تخمیرقند گلوکز باشدولی نتواند لاکتوز راتخمیرکندهمانند حالت قبل پس از3ساعت اول قسمت سطح شیبدار واستوانه هردو زرد میشود ولی پس ازآن به علت تمام شدن گلوکز درسطح شیب دار باکتری ازپپتون استفاده کرده وقسمت شیبدار قرمز میشود ولی کماکان قسمت استوانه ای لوله به علت تعداد کمتر باکتری زردرنگ باقی می ماند (آلکالن-اسید) ذ

درصورتیکه باکتری قادربه تخمیر گلوکزولاکتوزنباشدازابتداازپپتون استفاده کرده قسمت شیبدارواستوانه قرمز میشود

(الکالن-الکالن)

ب) مکانیسم شناسایی توانایی احیای گوکردوتولید سولفید هیدروژن

دراین محیط باکتریهایی که قادر به تولید سولفیدهیدروژن هستند در ترکیب با آهن موجوددرمحیط کشت رسوب سیاهرنگ تولید می کنند مانندپروتئوس ها

ج)مکانیسم شناسایی توانایی تولید گاز

برخی ازباکتریها درجریان واکنشهای متابولیسمی گاز هیدروزن ومحتوی دی اکسید کربن تولید می کنند که موجب تشکیل حباب ویا پاره شدن محیط می شودوگاهی تجمع گاز درعمق محیط باعث راندن محیط کشت به بالای لوله می گردد

Results (slant/butt)	Symbol	Interpretation
Red/yellow	K/A	Glucose fermentation only, Peptone catabolized
Yellow/yellow	A/A	Glucose and lactose and/or sucrose fermentation
Red/red	K/K	No fermentation, Peptone catabolized
Red/no color change	K/NC	No fermentation, Peptone used aerobically
Yellow/yellow with bubbles	A/A,G	Glucose and lactose and/or sucrose fermentation, Gas produced
Red/yellow with bubbles	K/A,G	Glucose fermented only, Gas produced
Red/yellow with bubbles and black precipitate	K/A,G, H2S	Glucose fermentation only, Gas produced, H2S produced
Red/yellow with black precipitate	K/A, H2S	Glucose fermentation only, H2S produced
Yellow/yellow with black precipitate	A/A, H2S	Glucose and lactose and/or sucrose fermentation, H2S produced
No change/no change	NC/NC	No fermentation

A=acid production; K=alkaline reaction; G=gas production, H2S=sulfur reduction

IMVIC

تستهای این مجموعه شامل بررسی اندول(محصول نهایی متابولیسم وشکسته شدن تریپتوفان)بررسی متابولیسم سیترات وتستهای متیل رد و وگس پروسکوئرمیباشد .

تولید اندول :

برخی ازباکتریها دارای آنزیم تریپتوفاناز هستند ومی توانند درمسیر متابولیسم اسیدآمینه تریپتوفان موجوددر محیط اندول تولید نماییند که بامعرف کواکس یا ارلیش واکنش می دهد .

روش کار

از محیط SIMکه حاوی اسیدآمینه تریپتوفان است استفاده می شود .باکتری رابه صورت عمقی درمحیط کشت داده ومحیط فوق رادر دمای37درجه به مدت 24تا48ساعت نگهداری کنیدپس ازآندرحدود5دهم میلی لیتر(5قطره)معرف کواکس یاارلیش به آن اضافه نماید درصورتیکه باکتری اندول آزاد کرده باشد حلقه قرمزرنگی درسطح محیط ظاهر خواهد شد مثل E.coli

نکته :درمحیطی که برای تست آنزیم تریپتوفانازبه کار می رود(SIM)قند گلوکز وجود نداردزیرا مانع از تولید اندول درمحیط می گردد در ضمن دراين محيط حركت وتوليد SH2 نيز مشاهده مي شود

تستMethyl Red :

برخی ازباکترها قادر به تخمیر مخلوط اسیدیMixed acid fermentation هستندواز تخمیر گلوکز تولید اسید می کنند اسید حاصل توسط معرفی مانند متیل رد مشخص می شود .

روش کار: باکتری را در محیط MR-VPکشت داده برای مدت 48ساعت در دمای37درجه سانتیگراد نگهداری نمایید . سپس باافزودن چند قطره معرف 4درصد متیل رد درصورت تولید اسید واکنش مثبت خواهد بود که دراین صورت PHمحیط کمتراز4/4بوده ورنگ قرمز ظاهر می شود(مثلE.coli) واکنش منفی بارنگ زرد مشخص می شودکهPHمحیط بیشتراز7خواهد بود .

معرف متيل رد

محيطي كه 48 ساعت انكوبه شده ومعرف متيل رد اضافه شده از جب به راستمثبت - مثبت - منفي - كنترل

تست(VP)

برخی از باکتریها دارای چرخه تخمیر بوتاندیول (BUtanediol fermentation) می باشند وازتخمیر گلوکز درمرحله نهایی مادهای به نام استیل متیل کربینول (استوئین)تولید می کنند . این ماده درمحیط قلیایی ودرحضوراکسیزن به دی استیل تبدیل می شود .دی استیل ایجاد شده دراثر تاثیر کاتالیتیک آلفا نفتول وکراتین به ترکیب قرمز رنگ تبدیل شده که اساس تستvp راتشکیل می شود .

روش کار :

باکتری رادرمحیط MR-VPکشت داده پس از 4ساعت نگهداری دردمای 37درجه سانتیگراد 6دهم میلی لیتر(6قطره)آلفانفتول وسپس 2دهم میلی لیتر KOHباغلظت 40درصد رابه آن اضافه نماییدوبه خوبی مخلوط کرده وبرای مدت15دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید . ظهور رنگ قرمز درمحیط نشاندهنده حضور استوئین ومثبت بودن VPاست مثل (کلبسیلا)

معرف VP

سمت جب :معرف (ألفا نفتول)راست:هيدروكسيد بتاسيم

Voges-Proskauer Test

سمت جب:كنترل و سمت راست : مثبت

تست سیترات :

باکتریهای که قادراند سیترات رابه عنوان تنها منبع کربن ومنبع انرزی ونمک آمونیوم رابه عنوان تنها منبع ازت جهت رشد خودبه کار برند قادراند محیط سیمون سیرات که حاوی معرف بروموتیمول آبی(سبزرنگ)است رابه رنگ آبی تبدیل کنند .

روش کار :

باکتری را درمحیط سیمون سیرات که به صورت سطح شیبدار است کشت دهیدودردمای37درجه سانتیگراد به مدت 24ساعت نگهداری کنید درصورتیکه رنگ سبز اولیه به رنگ آبی تبدیل شود واکنش مثبت است(مثل کلبسیلا_ رنگ سبز نشانه منفی بودن واکنش است

كلبسيلا بنومونيه وآنتروباكتر كولوأكه مثبت

اشيرشيا كولي :منفي

اتست اوره آز

باکتریهای که دارای آنزیم اوره آزباشند قادراند اوره موجود درمحیط راتجزیه کرده وآنرا به آمونیاک گاز کربنیک وآب تبدیل می کنند .

روش کار :

باکتری رادرمحیط اوره که دارای معرف فنل رد می باشد به صورت مایع یاآگار کشت دهیدپس از18 تا24ساعت درصورتیکه باکتری قادربه شکستن اوره باشد باتولید آمونیاک باعث قلیایی شدن محیط وموجب تغییر رنگ معرف فنل رد ازرنگ قرمز بهرنگ ارغوانی پررنگ می شود . PHمحیط در اینصورت بیشتر از8/4 خواهد بود .(مثل:پروتئوس)

Urea Hydrolysis

1 كنترل :منفي

2بروتيوس ولكاريس :مثبت

3اشيرشيا كولي :منفي

تست مالونات

باکتریهای که قادراند ازمالونات سدیم به عنوان تنها منبع کربن موجود جهت رشد خود استفاده کنند محیط راقلیایی کردهوPHمحیط بیشتراز7/6 می شود درنتیجه رنگ سبز به آبی تبدیل می شود .

روش کار:

باکتری را درمحیط مالونات که دارای معرف بروموتیمول بلو است کشت دهیدوپس از24ساعت نگهداری درگرمخانه37درجه سانتیگراد واکنش مثبت به صورت آبی ظاهر می شود(مانند سیتروباکتر دایورسوس)

تست لیزین

محیط لیزین آیرون آگار دارای اسید آمینه لیزین گلوکز وپپتون است معرف این محیط بروموکروزول ارغوانی است ورنگ اولیه محیط بنفش می باشد . این محیط معمولا بصورت شیب داروقسمت استوانه ای می باشد .

از آنجاییکه که توانایی باکتری در دآمیناسیون در شرایط هوازی وتوانایی باکتری برای دکربوکسیلاسیون درشرایط بیهوازی بررسی می گردد قسمت بالای لوله برای واکنش لیزین دآمیناز وقسمت استوانه به منظور بررسی واکنش لیزین دکربوکسیلاز مطالعه می شود .

باکتری درابتدابامتابولیسم گلوکز باتولید اسید باعث تغییر رنگ محیط به زرد می شودوپس از آن درصورتیکه باکتری قادر به دکربوکسیلاسیون لیزین باشد درعمق لوله آزمایش باجدا کردن بنیان کربوکسیل از اسید آمینه باعث قلیایی شدن محیط وتغییر رنگ آن به بنفش می شود .لذا درصورتیکه رنگ قسمت استوانه ای پس از24ساعت بنفش باشدنشانه توانایی باکتری دردکربوکسیلاسیون لیزین است .

درصورتیکه باکتری قادر به دآمیناسیون لیزین باشد درسطح شیبدار لوله آزمایش باجداکردن بنیان آمین از اسید آمینه باعث اسیدی شدن محیط می گردد .این مورد به همراه استفاده باکتری از پپتون درشرایط هوازی و تولید ترکیبات قلیایی باعث تغییر رنگ سطح شیبدار محیط به قرمز آلبالویی می گردد .

لذادرصورتیکه رنگ قسمت شیبدار پس از 24ساعت قرمز آلبالویی باشد نشانه توانایی باکتری در دآمیناسیون لیزین است ودرصورتیکه باکتری قادر به دآمیناسیون لیزین نباشد سطح شیبدار به رنگ بنفش دیده می شود .

روش کار:

یک کلنی از باکتری موردآزمایش را به وسیله آنس نوک تیز به محیط کشت لیزین آیرون آگار منتقل کنید .برای این منظور ابتدا درقسمت استوانه ای رابافروبردن مستقیم آنس تاعمق محیط کشت نموده وسپس قسمت شیبدار رابهصورت زیگزاگ تلقیح نمایید .محیط کشت رابه مدت 24ساعت درگرمخانه37 درجه سانتیگراد نگهداری نمایید وسپس واکنشهای دکربوکسیلاسیون ودآمیناسیون رابررسی کنید دراین محیط همچنین تولید SH2رانیز می توان بررسی کرد

صفات بیوشیمیایی آنتروباكترياسه ها

مطالب مشابه :

صفات بیوشیمیایی آنتروباكترياسه ها

معرفی خانواده انتروباکتریاسه enterobacteriacea

محیط های کشت افتراقی

محیط های کشت افتراقی

پروتئوس(انتروباکتریاسه)

عفونتهای مجاری ادراری و تشخیص آنها

تشخیص آزمایشگاهی عفونت دستگاه گوارش

همه چیز درباره شیگلا

آنزیم کاتالاز و انواع آن