پروتئوم و پروتئومیک

مقدمه
با تکمیل پروژه ژنوم انسان مشخص شد که مکانیسم مولکولی رفتار سلولها در شرایط مختلف را نمیتوان از روی توالی ژنهای آنها پیشگویی کرد. رفتار سلولی و تمام فعالیتهایی که در سلول انجام میشود بر عهده پروتئینها است. در واقع برای ارتباط ژنوم با رفتار سلولها باید پروتئینهای سلولها را شناخت. به کلیه پروتئینهایی که در یک سلول در یک زمان مشخص بیان میشود، پروتئوم آن سلول گفته میشود و این پروتئوم است که فاصله بین ژنوم و مکانیسم مولکولی رفتار سلولی را پر میکند.
برخلاف ژنوم، برای هر اورگانیسم نمیتوان یک پروتئوم واحد تعریف کرد. پروتئوم سلولهای مختلف با یکدیگر متفاوت اند. یعنی سلولها علاوه بر پروتئینهای ضروری که در همه انواع سلولها بیان میشوند ، دارای یکسری پروتئینهای اختصاصی نیز هستند. از این رو بهتر است پروتئوم را برای هریک از انواع سلولها تعریف نمود. با این حال پروتئوم یک نوع سلول نیز همیشه ثابت نیست. سلول در برابر شرایط مختلف محیطی و پیامهایی که از سلولهای اطراف دریافت میکند، پروتئینهای مختلفی را بیان میکند. بعبارت دیگر هر سلول تحت شرایط مختلف پروتئومهای متفاوتی دارد.
بنابر این برای شناسایی مکانیسمهای مولکولی رفتار سلولی و واکنشهای زیستی، لازم است پروتئینهایی که در یک سلول بیان میشود، تغییرات آنها در شرایط مختلف، عملکرد آنها و همچنین برهمکنشهای بین پروتئینهای مختلف در یک سلول، بررسی شود. به مجموعه این بررسیها، نقشه برداری پروتئوم یا پروتئومیک ، گفته میشود.

نقشه برداری پروتئـــوم
مطالعه پروتئوم به سادگی مطالعه ژنوم نیست. زیرا پروتئینها را نمیتوان(همانند DNA) به روشی مشابه PCR، تکثیر کرد. همچنین توالیهای پلیپپتیدی نمیتوانند به توالیهای اسید آمینه ای مکمل خود متصل شوند. بنابر این برای مطالعه پروتئوم باید از ابزار و روشهای ویژه ای استفاده کرد. در پروتئومیک نه تنها کلیه پروتئینهایی که در یک سلول دریک شرایط مشخص بیان میشوند، مورد بررسی قرار میگیرند، بلکه عملکرد و رفتار پروتئینها، برهمکنشهای بین پروتئینهای مختلف، آرایشهایی که پس از ترجمه بر روی پروتئینها ایجاد میشود و نیمه عمر آنها در سلول نیز مورد بررسی قرار میگیرد. در واقع پروتئومیک از سه بخش تشکیل شده است:
1- مشخص کردن کلیه پروتئینهایی که در سلول بیان میشود :در این بخش، کلیه پروتئینهایی که در سلول تحت یک شرایط معین (مانند، حالت استراحت، رشد، تمایز، بیماری، تاثیر دارو و...) مشخص میشود. به این ترتیب میتوان پروتئینهایی که در شرایط مختلف بیان میشوند یا میزان بیان آنها تغییر میکند را شناسایی کرد و به عملکرد آنها پی برد. شناسایی این پروتئینها در تشخیص بیماری و بررسی روند پیشرفت یا بهبودی آنها و همچنین شناسایی داروهای جدید، مفید می باشد.
2- نقشه برداری برهمکنشهای بین پروتئینی : پروتئینها در سلول بصورت منفرد عمل نمیکنند واغلب تاثیر خود را با همکاری پروتئینهای دیگر و برهمکنش با آنها اعمال میکنند. نمونه بارز برهمکنشهای پروتئینی، در مسیرهای انقال پیام و مسیرهای بیوسنتزی مشاهده میشود. با شناسایی این برهمکنشها، بطور کارآمدتری میتوان عملکرد و رفتار پروتئینها را مشخص کرد.
3- نقشه برداری آرایشهای پروتئینی : اغلب پروتئینها پس از ترجمه متحمل آرایشهای مختلفی مانند، گلیکوزیله شدن، متیله شدن،استیله شدن، فسفریله شدن و... میشوند.این آریشها بر فعالیت و عملکرد پروتئینها، همچنین ساختار فضایی، پایداری و نیمه عمر آنها تاثیر می گذارد. بسیاری از داروها گروههای الکتروفیلی دارند که از طریق آنها به پروتئین هدف متصل شده و اثر خود را اعمال میکنند.شناسایی این آرایشها، تاثیر آنها بر عمکرد پروتئینها و شرایطی که منجر به این آرایشها میشود، به شناسایی رفتار و عملکرد پروتئینها کمک میکند.

مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشود
با تهیه کتابخانههای cDNA برای انواع مختلف سلولهای بدن مشخص شده است که بطور متوسط در هر یک از سلولهای انسان، حدود 103*5 پروتئین مختلف بیان میشود. اما برای مطالعه پروتئوم سلولها نمی توان از کتابخانههای cDNA استفاده کرد. کتابخانههای cDNA فقط بیانگر کلیه mRNA های بیان شده در یک سلول (ترانسکریپتوم )میباشد. اما ترانسکریپتوم یک سلول مساوی با پروتئوم سلول نیست، زیرا بیان ژنها در سطح ترجمه نیز تنظیم میشود وممکن است از روی یک ژن mRNA ساخته شود ولی بدلیل تنظیم در سطح ترجمه آن پروتئین هرگز بیان نشود. همچنین میزان پروتئینهای مختلف در سلول تحت کنترل سیستم پروتئولیز نیز میباشد که با بررسی ترانسکریپتوم، نمیتوان آن را مشخص کرد. برای مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشود از روشهای استانداردی استفاده میشود که در ادامه به آنها اشاره میشود.
آ) بکارگیری ژل الکتروفورز دوبعدی وطیف سنجی جرمی
در این روش از دو تکنیک ژل الکتروفورز دوبعدی و طیف سنجی جرمی ، استفاده میشود. ژل الکتروفورز دوبعدی برای تفکیک پروتئینها از هم و طیف سنجی جرمی برای شناسایی پروتئینها بکار میرود. در این روش ابتدا کلیه پروتئینهای سلول مورد نظر استخراج شده و در حلال مناسب (حاوی اوره، دیتیوتریتول (DTT) ، بتا-مرکاپتواتانول و...) محلول میشوند وسپس به روش الکتروفورز دو بعدی از هم تفکیک میشوند. الکتروفورز دوبعدی یکی از قویترین روشهای تفکیک پروتئینها است. در الکتروفورز دو بعدی، ابتدا پروتئینها بر روی یک ژل نواری دارای گرادیان pH ، براثرمیدان الکتریکی ازهم جدا میشوند و هر پروتئین در مکانی که pH آن برابر pH ایزوالکتریک پروتئین است قرار میگیرد.در این مرحله پروتئینها بر اساس بار الکتریکی از هم جدا میشوند . سپس این ژل نواری به یک ژل دیگر برای انجام SDS-PAGE منتقل میشود، در این مرحله پروتئینها بر اساس وزن مولکولی ازهم جدا میشوند .پس از الکتروفورز دو بعدی، پروتئینها برحسب میزان بار الکتریکی و وزن مولکولی در مکانهای معینی از ژل قرار میگیرند که با رنگ آمیزی با کوماسی بلو یا رنگ آمیزی نقره، میتوان آنها را مشخص کرد. پس از رنگ آمیزی، مکان هر پروتئین بر روی ژل، بصورت لکههایی مشخص میشود. گاهی برخی از این لکهها شامل بیش از یک نوع پروتئین میباشند که بار و وزن مولکولی مشابهی دارند. بررسی این لکهها کار سادهای نیست و معمولا بوسیله نرم افزارهایی که برای این منظور تهیه شدهاند مانند؛ GELLAB، QUEST و MELANIE ، انجام میشود. این نرم افزارها قادرند لکههای مختلف را از هم تشخیص دهند و شدت رنگ هریک از لکهها، که بطور تقریبی مقدار کمی پروتئین را در نمونه مشخص میکند، را معین کنند. همچنین بکمک این نرم افزارها می توان چندین ژل، که از نمونه های مختلف بدست آمده اند، را بر هم منطبق کرد و پروتئینهای مشابه را در آنها مشخص کرد .از این طریق با مقایسه لکههای ژلهای مختلف، میتوان تعیین نمود که در نمونههای مربوطه چه پروتئینهایی اضافه یا حذف شدهاند .
پس از تفکیک پروتئینها بکمک الکتروفورز دوبعدی، نوبت به شناسایی پروتئین (یا پروتئینهای) مرتبط با هر یک از لکههای روی ژل میرسد. یکی از ساده ترین روشهای شناسایی پروتئینها، طیف سنجی جرمی میباشد. در طیف سنجی جرمی، نسب جرم به بار (M/Z) قطعات پپتیدی اندازه گیری میشود. معمولا برای بررسی پروتئینها از دو نوع طیف سنجی جرمی استفاده میشود؛ طیف سنجی جرمی MALDI وطیف سنجی جرمی ESI . برای شناسایی پروتئینها به روش طیف سنجی جرمی، ابتدا لکه مورد نظر از ژل جدا شده و پروتئین آن استخراج میشود. سپس بوسیله تریپسین، پروتئین به چندین قطعه پپتیدی شکسته میشود . در مرحله بعد، بوسیله طیف سنجی جرمی نسبت جرم به بار برای هر یک از این قطعات بدست میآید. برای مخلوط قطعات پپتیدی حاصل از هر پروتئین، طیف جرمی بدست میآید که به اثر انگشت جرمی پروتئین ، معروف است. این اثر انگشت برای هر پروتئین اختصاصی است واز روی آن میتوان پروتئین را شناسایی کرد.
برای شناسایی پروتئینها از روی اثر انگشت جرمی آنها، از بانکهای اطلاعاتی که در مورد توالی پروتئینها وجود دارد، مانند بانک اطلاعاتی SWISS-PROT ، و تکنیکهای بیوانفورماتیک استفاده میشود. برای این منظور بوسیله نرم افزارهای خاصی، مانند PeptIdent ، توالی کلیه پروتئینهای موجود در بانک اطلاعاتی بصورت مجازی بوسیله تریپسین برش داده شده و اثر انگشت جرمی مجازی آنها بدست میآید. سپس اثر انگشت جرمی پروتئین مجهول با اثرهای انگشت مجازی موجود در بانک اطلاعاتی مقایسه شده و پروتئین مورد نظر شناسایی میشود. در این روش میتوان از اطلاعات موجود در بانکهای اطلاعاتی که در مورد توالی کلیه ژنهای شناسایی شده وجود دارد، مانند Gene Bank ، استفاده کرد. در این صورت ابتدا باید توالی نوکلئوتیدی را به توالی اسید آمینهای تبدیل کرد.

ب) بکارگیری کروماتوگرافی مایع وتعیین توالی پپتیدها
در این روش از کروماتوگرافی مایع (LC) و در برخی موارد از HPLC ، برای تفکیک پروتئینها از هم استفاده میشود. برای این منظور ابتدا کلیه پروتئینهای سلول مورد نظر استخراج شده و بوسیله تریپسین، بصورت قطعات پپتیدی شکسته میشوند. سپس قطعات پپتیدی بوسیله LC یا HPLC از هم تفکیک میشوند. در مرحله بعد، توالی هر یک از قطعات پپتیدی بوسیله نوعی طیف سنجی جرمی بنام طیف سنجی جرمی متوالی ، یا MS/MS تعیین میشود. در این روش برای تعیین توالی کل پروتئین از روی توالی پپتیدهای سازنده آن، از اطلاعات موجود در بانکهای اطلاعاتی که در مورد توالی پروتئینها ، ویا حتی بانکهای اطلاعاتی در مورد توالیهای نوکلئوتیدی( بخصوص بانکهای اطلاعاتی در مورد توالیهای ETS ) وجود دارد، استفاده میشود. انطباق توالیهای پپتیدی با توالیهای پروتئینی موجود در بانکهای اطلاعاتی، بوسیله نرم افزار SEQUEST، انجام میشود. به این ترتیب میتوان مشخص کرد که در نمونه مورد بررسی چه پروتئینهایی بیان شده است. همچنین با مقایسه پروتئینهای بیان شده در نمونههای مختلف، میتوان تعیین نمود که در آنها چه پروتئینهایی اضافه یا حذف شدهاند.

ج)استفاده از ریزآرایه های پروتئینی
یکی از تکنیکهای در حال پیشرفت و قدرتمند در مورد مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشوند، بیوچیپها یا ریزآرایه های پروتئینی است. ریزآرایه های پروتئینی از تعداد زیادی آنتی بادی ، که در کنار هم با نظم خاصی قرار گرفتهاند، تشکیل شدهاند. هر یک آنتی بادیها پروتئین ویژهای را شناسایی میکند و در مکان معینی قرار گرفته است. بیوچیپهای پروتئینی انواع مختلفی دارند. برخی از آنها، از تغییر پارامترهای الکتریکی که در هنگام اتصال پروتئین به آنتی بادی ایجاد میشود، برای شناسایی پروتئینها استفاده میکنند. در انواعی از بیوچیپها نیز از نشاندار کردن پروتئینها با مواد فلوئورسانت، برای شناسایی پروتئینها استفاده میشود . برای مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشوند، ابتدا کلیه پروتئینهای سلول استخراج شده و سپس با بیوچیپ مجاور میشوند. هر یک از پروتئینهای سلول به آنتی بادی مربوط به خود بر روی چیپ متصل میشود که با اسکن کردن سطح بیوچیپ (در مورد بیوچیپهایی که از روش فلوئورسانت استفاده میکنند) یا آنالیز سیگنالهای الکتریکی، میتوان به حضور هر یک از پروتئینها در عصاره سلولی پی برد. بدلیل اینکه هنوز برای همه انواع پروتئینهایی که اطلاعات مربوط به آنها در بانک اطلاعاتی SWISS-PROT موجود میباشد، آنتی بادی ساخته نشده است هنوز کاربرد بیوچیپهای پروتئینی فراگیر نشده، اما این تکنیک به سرعت در حال پیشرفت است. در برخی از انواع بیوچیپهایی که برای بررسی پروتئوم ساخته شده اند، از آرایهای از آپتامرها بجای آنتیبادی استفاده شدهاست. آپتامرها مولکولهایی از RNA یا DNA هستند که میتوانند همانند آنتیبادیها پروتئینهای مختلف را شناسایی کنند. اما آپتامرها نسبت به آنتی بادی ها بسیار اختصاصی تر عمل می کنند وبا قدرت بیشتری به لیگاند متصل می شوند. از دیگر مزایای آپتامرها این است که سنتز آنها بر علیه انواع مختلف پروتئینها بسیار سادهتر از آنتیبادیها است.

نوشته:محمد رضا خزاعی

پروتئوم و پروتئومیک

مطالب مشابه :

الکتروفورز دو بعدی

پزوتئومیکس

الکتروفورز دو بعدی چیست

پروتئوم و پروتئومیک

الکتروفورز دو بعدی چیست ؟

پروتئومیکس Proteomics

two-dimensional elechtrophoresis

شاخه بندی شیمی تجزیه