ژنتیک و اصلاح نباتات

روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت) - بخش اول

انتقال صفات با ارزش به گیاهان زراعی از گذشته های دور با استفاده از روشهای کلاسیک (عمدتا دورگ گیری)، صورت می گرفت. در این روشها محدودیت منبع ژن، بازدارنده اصلی توفیق در برنامه های اصلاحی است. مفهوم این عبارت این است که برای انتقال یک ژن با ارزش باید آن ژن در منبع ژن آن گونه خاص ویا حداکثر گونه های نزدیک قابل تلاقی با گونه مدنظر موجود باشد. در صورتی که این صفت در گونه ای دور از خانواده یا راسته ای متفاوت یافت شود اصلاح نباتات سنتی نمی تواند کاری از پیش ببرد. مهندسی ژنتیک و روش های مختلف انتقال ژن، امکان انتقال ژنهای مورد نظر را از هر موجودی به موجود دیگر فراهم کرده است.

روش های انتقال ژن در گیاهان شامل موارد زیر می باشند:

1- انتقال غیر مستقیم:

1-1- انتقال ژن از طریق اگروباکتریوم

2- انتقال مستقیم:

2-1- انتقال ژن بروش بمباران ذره ای

2-2- الکتروپوریشن

2-3- ریز تزریقی و درشت تزریقی

2-4- تراریختی از طریق لیپوزوم

2-5- انتقال ژن با استفاده از پلی کاتیون ها

1- انتقال غیر مستقیم

1-1- انتقال ژن از طریق آگروباکتریوم

در سال 1907 گزارش Smith و Townsendمبتنی بر این که عامل ایجاد بیماری گال طوقه (Crown Gall) یک باکتری گرم منفی هوازی و میله ای شکل به نام آگروباکتریوم تومفاسینس (Agrobacterium tumefaciens) است، انتشار یافت. این پاتوژن بطور عمده از طریق زخمهای ایجاد شده بر روی اندامهای زیر زمینی و طوقه، وارد گیاه شده و از طریق القای رشد بی رویه در سلولهای این منطقه ایجاد بیماری گال طوقه می نماید. بعدها در سال 1974 مطالعات Zaenen و همکارانش نشان داد که ژنهای موجود بر روی یک قطعه DNA خارج کروموزومی باکتری بطول بیش ازKbp ع200 عامل ایجاد آلودگی در گیاه می باشد. این قطعه در واقع شامل پلاسمیدی بود که در سال 1975 توسط Van Larebecke و همکاران بعنوان پلاسمید القاء کننده تومور(Tumor inducing Plasmid) یا پلاسمید Ti نام گرفت. از این زمان باکتری آگروباکتریوم بخاطر قابلیت انتقال قطعه ای از پلاسمید خود به نام انتقالی (Transfer DNA) یا T-DNA به درون سلول میزبان و ابراز طبیعی آن به همراه ژن های میزبان مورد توجه ویژه ای قرار گرفت. طول قطعات T-DNA بسته به اینکه از چه سویه هایی از باکتری منشا گرفته باشند از 12 تا 24 کیلو جفت باز متغیر است. T-DNA دارای دو گروه از ژنها می باشد، گروه اول که به نام ژنهای انکوژن شناخته می شوند، قادر به تولید آنزیمهایی هستند که در ساخت سیتوکینین و اکسین دخالت داشته و عملا تولید تومور می کنند. گروه دوم ژنهایی هستند که مواد خاصی به نام اپاین می سازند که توسط باکتری بعنوان منبع کربن و نیتروژن مورد استفاده قرار می گیرند. تقسیم بندی پلاسمید Tiبر مبنای اپاین هایی است که تولید می نماید و بر همین مبنا، پلاسمیدهای نوپالینی، اکتوپینی، اگروپینی و مانوپینی شناسایی شده اند.

سویه هایی از باکتری آگروباکتریوم که فاقد پلاسمید Tiمی باشند دارای خاصیت گال زایی در گیاه نمی باشند.

اولین مرحله در انتقالT-DNA به گیاه، جذب باکتری بروی زخم های موجود بر روی سلولهای ناحیه ابتدایی ساقه و طوقه گیاه می باشد. در واقع تصور می شود که زخم های ایجاد شده موانع فیزیکی موجود بر سر راه انتقال باکتری بدرون گیاه را مرتفع ساخته و از این طریق انتقال T-DNA را تسهیل می بخشند.

امروزه ثابت شده است که عکس العمل باکتری ها غالبا در اثر وجود بعضی از مواد فنولیک همانند Acetosyringone و Hydroxyacetosyringone در محیط است که از بافت های مجروح ترشح می شوند. این مواد در حقیقت قسمتی از محصولات متابولیسم فنیل پروپانویید در گیاه به شمار می آیند که چرخه اصلی ساخت متابولیت های ثانویه از قبیل لیگنین و فلاونوئیدها را شامل می شود. ترکیبات فنولیک مذکور در واقع بعنوان محرک فعالیت برخی از ژنهای موجود بر روی پلاسمید Tiعمل کرده که نقش مهمی را در مراحل انتقال T-DNA به گیاه برعهده دارند. این گروه از ژنها به نام ژنهای بیماریزا (Virulence Genes) و یا ژنهای Vir نامیده می شوند. ژنهای بیماری زا، بر روی ناحیه ای از پلاسمید Ti بطول 35 کیلو جفت باز استقرار یافته اند. محصولات ژنهای بیماریزا برای انتقال و جایگزینی قطعه T-DNA بدرون ژنوم گیاه ضروری هستند. لازم به ذکر است که جهت القای خاصیت تراریختی، قطعه T-DNA و ژنهای بیماری زا ملزم به استقرار بر روی یک پلاسمیدTi واحد نمی باشند. این بدان معنی است که اگر یک باکتری حاوی پلاسمید و ژنهای بیماری زا و باکتری دیگر حاوی قطعه T-DNA و ژن مورد نظر باشد، قادر خواهند بود فرآیند انتقال T-DNA را بدرون ژنوم گیاه با موفقیت به ثمر برسانند(ناقل های دوگانه).

اولین مورد تراریختی گیاهان توسط Herrera-Estrella در سال 1983 در گیاه تنباکو گزارش گردید. اگرچه آگروباکتریوم بطور طبیعی تنها گیاهان دولپه را آلوده می سازد، اما با درک عمیق مکانیسم انتقال ژن به گیاهان، انتقال ژن به گیاهان تک لپه با استفاده از اگروباکتریوم نیزمیسر گردید، در حال حاضر برنج، موز، گندم، ذرت و نیشکر از گیاهان تک لپه بخوبی تراریخت و باززائی می شوند.

مزایا و معایب روش آگروباکتریوم

مزایا: جوابدهی بسیار بالا برای گیاهان دولپه و بخصوص خانوده سولاناسه، انتقال با کیفیت بالا، تعداد پایین کپی نامبر ژن (تعداد زیاد کپی نامبر ژن، سبب تداخل اثر ژنها می گردد)، دست نخوردگی قطعات ژن (عدم شکستگی، موتاسون کمتر). معایب: بسیار وابسته به کشت این ویترو است و برای هر گونه گیاهی باید از متود ویژه ای برای کشت این ویترو استفاده کرد. ژنوتیپها تحت تاثیر تغییرات سوماکلونال می باشند.

2- انتقال مستقیم:

توسعه و تکامل ناقلین ژنی در گیاهان غالبا بر اساس انتقال DNA از طریق میزبانهای واسطه باکتریایی صورت گرفته است. در مواردی که انتقالDNAخارجی از این طریق امکان پذیر نیست، روشهای انتقال مستقیم، بر اساس نوع هدف و خصوصیات بافت مورد نظر بکار برده می شوند. در واقع تراریختی مستقیم روشی است که در آن سلولهای میزبان بدون کمک میزبان واسطهDNA خارجی را دریافت می کنند.

دانشمندان علم بیولوژی مولکولی گیاهی امروزه در فکر بکار بستن روشهای نوین در انتقال ژن به غلات هستند. غلات، بعنوان عمده ترین محصولات زراعی، حساسیت کمتری نسبت به آلودگی از طریق آگروباکتریوم و انتقال DNA از خود نشان می دهند و بنابراین محققین عمدتا از روش بمباران ذره ای برای انتقال ژن به خانواده گرامینه استفاده می کنند.

در تراریختی مستقیم، DNA خارجی از طریق تکنیک های مختلف فیزیکی بدرون پروتوپلاست سلولی انتقال می یابد. در ادامه به شرح مختصری در مورد روشهای متداول انتقال مستقیم ژن می پردازیم.

2-1- انتقال ژن بروش بمباران ذره ای

انتقال ژن بروش بمباران ذره ای اولین بار توسط Sanford و همکاران در سال 1987 گزارش شد که در منابع مختلف به نامهای تفنگ ژنی و روش زیست پرتابی نیز مورد اشاره قرار گرفته است. در این روش اسید نوکلئیک بر روی ذراتی از جنس تنگستن و یا طلا به قطر 5 تا نیم میکرون قرار داده شده و با سرعت زیاد (معادل سیصد تا ششصد متر بر ثانیه) توسط گاز هلیوم بداخل بافت های سالم فرستاده می شود.

ذرات ناقل ((Microcarriers پس از قرار گرفتن بر روی یک غشا ناقل (Macrocarriers) با فشار در داخل محفظه تفنگ ژنی پرتاب شده و پس از برخورد با صفحه ای به نام صفحه متوقف کننده (از جنس یک توری فلزی)، بداخل بافت مورد نظر نفوذ می یابند. در چنین شرایطی این ذرات قابلیت نفوذ بدرون غشا سلولی بدون آسیب رساندن به آن را دارا می باشند.

انتقال ژن از طریق بمباران ذره ای یکی از مناسب ترین روشهای انتقال مستقیمDNA در سولهای گیاهی، جانوری، باکتریایی و نیز در سطح اندامک های سلولی می باشد.

عوامل موثر در انتقال DNAبروش بمباران ذره ای را می توان در سه گروه خصوصیات مربوط به ذرات حامل، شتاب دهنده (Particle accelerator) و نمونه مورد آزمایش خلاصه نمود. عوامل مربوط به ذرات حامل شامل اندازه، مقدار و نوع ذرات حامل و در مورد شتاب دهنده شامل فشار گاز بکاررفته، فاصله مابین غشاحامل و صفحه پاره شونده (Rupture Disk)، فاصله بین غشا حامل و صفحه متوقف کننده (مسافت سیر غشا حامل) و در نهایت فاصله مابین نمونه با صفحه متوقف کننده (مسافت هدف) می باشد.

در این روش با افزایش غلظت DNA تا حد معینی می توان فراوانی سلولهای تراریخت را افزایش داد. از آنجایی که سلولهای انتقال یافته بطور موقت و ناپایدار باعث بیان ژن خارجی می شوند، از این روش در مطالعات مربوط به ابراز ناپایدار ژن Transient gene expressionاستفاده می شود.

در واقع مادامی کهDNAخارجی با ژنوم تلفیق نیافته است، تقسیم سلول های تراریخت موجب حذف تدریجی آن می شود، ولی اگرDNA وارد شده به هسته برسد و وارد ژنوم شود، تراریختی پایدار خواهیم داشت.

ساختار و نوع DNA ناقل نیز در تلفیق و تظاهر ژنهای خارجی در درون میزبان بسیار موثر می باشند. بعنوان مثال راندمان تراریختی در حالتی که DNA بکار رفته از نوع خطی می باشد، به مراتب بیش از DNA حلقوی می باشد و همچنین ناقلین پلاسمیدی بزرگ (بیش از 10 کیلو باز) در مقایسه با ناقلین کوچکتر معمولا از میزان ابراز ژن کمتری بدلیل قطعه قطعه شدن DNA در هنگام بمباران ذره ای برخوردارند، به همین دلیل ناقلین مورد استفاده در روش انتقال از طریق آگروباکتریوم معمولا در این روش کاربرد نداشته و از ناقلین با ساختار بهینه سازی شده استفاده می شود. بعنوان مثال پلاسمید pBI221در واقع شامل بسته ژنی 35S-GUS- Nos از پلاسمید pBI121 بوده که جهت انتقال مستقیم، در پلاسمید pUC19 کلون شده است.

مزایا و معایب روش بمباران ذره ای

مزایا: جوابدهی بسیار بالایی دارد، مثلا در آفتابگردان بدلیل سختی انتقال ژن، فقط روش بمباران ذره ای موثربوده است. معایب: وابستگی به کشت این ویترو، امکان دست خوردگی قطعات ژنی، پایین بودن دقت کار (ممکن است ژن وارد هسته نشود ویا حتی از سلول گیاه عبور کند).

پروتکل انجام بمباران ذره ای در برنج بطور خلاصه بدین شرح است:

ذرات طلا با استفاده از پلاسمید حامل ژن بتا گلوکورونیداز (GUS)، توالی ژنی هدف و ژن مقاومت به هیگرومایسین ب پوشش داده می شوند. کالوس های جنین زای برنج با استفاده از این ذرات بوسیله یک دستگاه تفنگ ژنی بمباران می شوند و پس از یک تا 2 روز، فعالیت ژن بتاگلوکورونیداز با استفاده از رنگ آمیزی بافت کالوس به کمک سوبسترایی که در حضور آنزیم حاصل از فعالیت این ژن ایجاد رنگ آبی می کند (سوبسترای 5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل بتا دی گلوکورونید)، مورد مطالعه قرار می گیرد. گروه 5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل در اثر هیدرولیز توسط آنزیم و مولکول اکسیژن، دایمری را تشکیل می دهد که همان رسوب آبی رنگ می باشد که بصورت نقاط یا لکه هایی در کالوسها قابل مشاهده می باشند. کالوس های تراریخته (دارای لکه های آبی رنگ) را به محیط کشت مخصوص القای کالوس (حاوی هیگرومایسین ب) منتقل می کرده و بمدت 15 روز در اتاق تاریک قرار می دهند. کالوس هایی که در این محیط کشت زنده مانده و رشد فعالی نشان می دهند (در این آزمایش، از ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین بعنوان ژن نشانگر استفاده شده است) را به محیط کشت مخصوص باززایی منتقل کرده و در اتاق روشن قرار می دهند. هر دو هفته یکبار کالوسها را به محیط کشت تازه مخصوص باززایی منتقل می نمایند تا تولید گیاهچه نمایند. پس از رشد گیاهچه ها، باید آنها را به محیط کشت مخصوص ریشه زایی منتقل و پس از ریشه زایی، گیاهچه ها را به محیط کشت مایع یوشیدا منتقل می کنند. پس از 10 تا 15 روز گیاهچه ها را درگلدانهای حاوی خاک به گلخانه می برند. پس از این مرحله، جهت اطمینان از قرار گرفتن ژن در محل هدف ژنوم گیاه میزبان و بیان مناسب و مطلوب آن (تعداد کپی نامبرهای انتقال یافته از ژن هدف)، آنالیزهای مولکولی لازمه چون ساترن، وسترن و الایزا و غیره انجام خواهد گرفت.

ژنتیک و اصلاح نباتات

مطالب مشابه :

ویروسهای بیماریزای حشرات

ویروس های گیاهان

روش ها و زمان مناسب باردار شدن در خانم ها

ویروس های گیاهی

روش ها و زمان مناسب باردار شدن در خانم ها

چگونه باردار شویم؟

تحقیق درباره ی ورزش

ژنتیک و اصلاح نباتات

روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت) - بخش اول

روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت) - بخش اول