بهبود سريع گياهان زراعي با استفاده از روش کشت بافت

مقدمه:
در طول سه دهة گذشته، پیشرفت اصلی در تولید گیاهان زراعی خوراکی با استفاده از کاربرد کود، آبیاری، آفت کش، علف کش، مکانیزاسیون و ارقام اصلاح شدة زراعی بود. تمام این عملیات به استثناء آخرین تغییرات محیطی اعمال شده جهت متناسب ساختن آن برای گیاهان، بطور کامل در مناطقی از جهان که بهبود کشاورزی توسط این روش ها عیناً صورت گرفته است. بعلاوه، افزایش هزینة انرژی موانع بسیار شدیدی جهت کاربردشان در کشورهای کمتر توسعه یافته ایجاد می کند، و در آینده حتی ملت های صنعتی نیز ممکن است هزینه هایشان را بازدارنده تلقی نماید. یک راه برای کاهـش این هـزینه ها و برای ادامـه دادن به تولید غذا این است که ارقام جدید گیاهی را تولید کنند که به تغییرات محیطی کمتری نیاز داشته و بطور اختصاصی برای محیطهای محلی توسعه یافته باشد.
اصلاح کنندگان ارقام گیاهی جدیدی را با الحاق آللهای جدید مفید یا ترکیبات آللی در داخل خزانة ژن ارقام مورد کاشت تولید نمودند. بطور سنتی، اینکار یا بوسیلة اصلاح ارقام اهلی یا وحشی موجود، یا با انتخاب موتانتهای خودبخودی یا القاء شده حامل صفات مطلوب صورت می گیرد. هرگاه صفات خاصی را در یک گیاه توسط هر کدام از روش ها جدا کنیم، آسانی کار برای اصلاح گیاه به پروسة گشنیده شدن یک گونة گیاهی خاص بستگی خواهد داشت. در گونه های خود گشن صفت به آسانی در گیاهان تکثیر شده استقرار پیدا می کند. در گونه های دگرگشن معرفی یک صفت جدید کند و دشوار می باشد.
ارقام اهلی یا وحشی دگرگشن می تواند بالقوه چندین ژن جدید را به بهترین ژنوتیپ موجود اضافه نماید، ولی به چندین نسل اصلاحی برای تثبیت تنوع دگرگشنی حاصله مورد نیاز می باشد. بعلاوه، حمل صفت مطلوب توسط رقم اهلی و یا وحشی امری غیر معمولی نیست. انتخاب موتانت های خودبخودی و یا القاء شده می تواند نیاز به تثبیت را معلوم سازد و ابتدائاً برای افزایش یک ژن در یک زمان به یک ژنوتیپ بکار رفته است. در حالیکه، چندین مورد معایب منطقی و اقتصادی برای این روش نیز وجود دارد.
در اثر میزان کم موتاسیون (در 1000000تا100000000 فقط یک گیاه دارای موتانت خودبخودی برای یک صفت مطلوب خواهد بود)، جداسازی موتانتهای خودبخودی از گیاهان رشد یافته در مزرعه نیاز به آزمون تعداد زیادی از گیاهان دارد. این به نوبة خود درگیر با مقدار زمان اجرایی و دشواری کار بسیار زیاد، که همه با هزینه های بسیار بالا هم همراه هستند می باشد. در روش های انتخاب برای کاهش عملیات بیشتر از قلمه ها استفاده می کنند تا گیاهان رشد یافته در مزرعه. به هر حال قلمه ها در مقایسه با گیاهان بالغ به شکل های متفاوتی به یک عامل انتخابی پاسخ می دهند. بعلاوه صفات مطلوب مشخص (مانند رفتار رشدی) به آسانی توسط مشاهدات مزرعه ای مشخص می شود، در حالیکه صفاتی نظیر پروفیل های اسیدآمینه را نمی توان مشخص کرد. موتانت های دیگری مثل مقاومت به علف کش و تحمل به شوری نیاز به این دارند که گیاهان با فشار انتخاب در گیر شوند.
القاء موتاسیون در بذور یا دانة گرده موجب افزایش فراوانی فنوتیپ های مطلوب، ولی موجب کاهش تعداد گیاهان مورد انتخاب می گردد. از نظر آماری، احتمال یک موتاسیون مضر بیشتر از یک موتاسیون مفید است. در مورد وقوع یک موتاسیون مفید در یک بذر، مشکل اصلی در این است که طبیعت پر سلولی جنین از نظر آماری پیدا کردن تمام سلولهای اولین نسل گیاهان موتانت که حاوی موتاسیون های مشابه در همان نسل باشند غیر ممکن است. این موجب ایجاد مشکل وراثت شیمری شده و ممکن است پیش از آینکه یک ذخیرة خالص بدست بیاید به تعداد بیشتری فصول اصلاحی نیاز باشد. ایجاد موتاسیون در دانة گرده پیش از لقاح موجب ایجاد مشکلاتی در اخذ تعداد زیادی از گیاهان بالقوه موتانت می شود. محدودیت، هزینه و تنها با موفقیت های اخیر در تولید مفید گیاهان از موتاسیون های القائی در بذر می تواند به مخارج زیاد و سرمایه گذاری فیزیکی در حمل تعداد زیادی بذر در خلال چندین نسل اصلاحی آنهم برای تثبیت یک صفت خاص نسبت داده شود.
به این دلایل، بررسی سایر تکنولوژیهای در حال توسعه که بسیاری از این موانع را کاهش دهد یا حذف نماید مناسب می باشد. پیشرفت های اخیر در کشت سلولهای گیاهی روشی را برای جدا سازی سریع موتاسیون های مطلوب در گیاهان زراعی پیشنهاد می نماید. میلیونها گیاهان بالقوه را می توان در یک فلاسک یا لولة آزمایش رشد داد، در حالیکه می توان برای فنوتیپ های موتانت انتخاب نیز انجام داد. کشت سلول گیاهی بطور قابل ملاحظه ای از میزان زمان، فضا، و دشواری کار مورد نیاز برای تولید یک واریتة جدید می کاهد، و انعطاف بیشتری در انتخاب صفات مطلوب در گیاهان زراعی ایجاد می کند.
روش های کشت سلولی:
تولید گیاهان موتانت بوسیلة روش های کشت سلولی را می توان به چهار مرحله تقسیم نمود: a) شروع کشت سلولی، b) انتخاب فنوتیپ سلولی موتانت مطلوب، c) بازرشد سلول های موتانت به گیاه کامل و d) آزمون گلخانه ای و مزرعه ای. این بحث خلاصة روش کلی و جزئی روش های ویژة بکار رفته آزمایشگاهی برای بدست آوردن گیاهان متحمل به شوری محسوب می شود.

در مرحلة اول، گروهی از سلول های گیاهی از یک گیاه حذف شده و بطور ضد عفونی بر روی یک محیط کشت جامد یا مایع کشت می شوند. از نظر شکلی، قطعه ای از یک گیاه (قطعه ای از ریشه، ساقه یا برگ) را با کلراکس 20% به مدت 10-20 دقیقه ضدعفونی سطحی نموده و در داخل یک لولة آزمایش حاوی محیط کشت آگار جامد با غلظت های معین شکر، مواد معدنی، ویتامین ها، و هورمون های رشد گیاهی قرار داده می شود.یک محیط کشت پایة کاملاً مفید متعلق به لینسمایر و اسکوگ (1965) به صورت زیر است:

A. نمک های غیر آلی
1. NH4NO3 1650 میلیگرم در لیتر (بطور متوسط)
2. KNO3 1900
3. CaCl2. 2H2O 440
4. MgSO4. 7H2O 370
5. KH2PO4

B. عناصر کم مصرف
6. MnSO4 16.9 میلیگرم در لیتر (بطور متوسط)
7. ZnSO4. 2H2O 10.3
8. H3BO3 6.2
9. KI 0.83
10.Na2MoO4. 2H2O 0.25
11.CuSO4. 5H2O 0.025
12.CoCl2. 6H2O 0.025

C. مواد آلی
13. Thiamin HCl 0.4 میلیگرم در لیتر (بطور متوسط)
14. myo-inositol 100.0

A. نمک های غیر آلی
15. EDTA-Ferric salt 50.0 میلیگرم در لیتر (بطور متوسط)

غیره
Sucrose 40 گرم در لیتر
Agar 10 گرم در لیتر
Medium pH 5.5 میلیگرم در لیتر

ترکیبات هورمونی محیط کشت برای تحریک تکثیر سلول ها به شکل توده ای تمایز نیافته از سلول ها که "کالوز" نامیده می شود تنظیم شده اند .این معمولاً با کاربرد سطوح بالای (2-40 میلی گرم در لیتر) اکسین (یک هورمون گیاهی) که موجب تحریک تقسیم سلولی ولی باعث جلوگیری از تشکیل ساقه و ریشه می گردد. اکسین مخصوص بکار رفته همانند غلظت های مختلف از گونه ای به گونة دیگر و گاهی از واریته ای به واریتة دیگر فرق می کند.
در مورد آزمایشات طراحی شده برای بدست آوردن توتون، یولاف، و گندم متمل به شوری، لاین های سلولی از قسمتی از ساقة توتون و از بذور یولاف و گندم حاصل شد. در مورد قطعه ای از ساقة توتون، سلول ها رشد کرده و برای تولید کالوزهای به اندازة ناخن شصت تقسیم شده که خود حاوی حدود 50000 سلول در 2 تا 3 هفته خواهد شد. محیط کشت القاء تکثیر سلولی در توتون سامسون حاوی 5 میلی گرم ایندول استیک اسید بعلاوه 5/0 تا 5 میلی گرم در لیتر کینتین می باشد. در مورد گندم و یولاف بذر بر روی محیط کشت پایه حاوی 2-5 میلی کرم در لیتر 2،4- دیکلروفنوکسی استیک اسید جوانه می زند. سلول های ریشه در حال جوانه زدن توسط اکسین برای رشد و تقسیم تحریک شده و منجر به تولید تودة کالوز می شود. برای هر سه گیاه کالوز اولیه حاصله از قطعه ای از گیاه را می توان کشت مجدد نموده و از آن کالوز ثانویه بدست آورد. وقتی به مقدار کافی کالوز بدست آمد، قسمتی از کالوز را گاهی در یک فلاسک حاوی محیط کشت مایع بر روی یک شیکر گردان (Gyratory shaker) قرار می دهند.حرکت مکانیکی شیکر موجب پخش شدن کالوز و تبدیل آن به مجموعه های کوچکی از سلول و تک سلول ها می شود که به آن "سوسپانسیون سلولی" می گویند. هنگامی که تراکم سلول به حداکثر مقدار خود رسید، سوسپانسیون سلولی را کشت مجدد می نماید.
سوسپانسیون سلولی حاوی تعداد زیادی سلول است. یک کشت سوسپانسیون 100 میلی لیتری می تواند دارای 107 سلول باشد که تقریباً هر سلول قدرت ژنتیکی تولید یک گیاه کامل را دارا می باشد. اگرچه هر سلول دارای ژنتیک معین می باشد و تولید گیاهان با ژنتیک معین می نماید، موتاسیون های خودبخودی در شرایطی انتخاب می شوند که وقتی کل سوسپانسیون سلولی یا کشت کالوز در آن شرایط قرار داده می شوند، سلول های طبیعی رشد کند نشان داده و یا رشدشان متوقف می شود، در حالیکه سلول های موتانت مورد نظر دارای رشد مناسب می باشند. مثلاً با افزاژش تذریجی سطح NaCl در کشت سوسپانسیونی توتون در مرحلة 600 میلی گرم در لیتر، سلول های متحمل به NaCl انتخاب می شوند، زیرا رشد و تقسیم سلولیشان مطلوبتر به نظر می آید. بنابراین، یک کشت کامل (107 سلول در 100 میلی لیتر) از گیاهان بالقوه متحمل به NaCl در ظرف چند ماه بدست آمد. در کشت توتون در چندین لاین سلولی تحمل NaCl برابر با 8000 میلی گرم در لیتر بدست آمد. بدست آوردن تحمل تا این اندازه در سوسپانسیون غیر ممکن به نظر می آید. این ممکن است ناشی از ناتوانای ژنتیکی در سلول ها به سازگاری با غلظت نمک بالای این سطح باشد. لاین های سلول توتون متحمل به نمک را می توان با افزودن NaCl به محیط کشت جامد حامی رشد کالوز نیز انتخاب نمود. جدول 1 داده هایی را که بیانگر این نوع انتخاب باشند را نشان می دهد. برای یولاف و گندم، انتخاب لاین های سلول متحمل به NaCl بر روی محیط کشت جامد با کاربرد افزایش 1000 میلی گرم در لیتر NaCl در هر مرحله انجام شده است. در هر دو گونه تحمل به 9000 میلی گرم در لیتر بدست آمده است.
در مرحلة نهایی، سلول ها به گیاهی کامل بازرشد داده می شوند. سلول ها را از کشت سوسپانسیون برداشت کرده و بر روی محیط کشت جامدی که رشد ساقه و ریشه را تحریک می کند قرار می دهند. برای بعضی از گونه ها یک محیط کشت برای القائ ساقه دهی و محیط کشت دیگری برای القاء ریشه دهی بکار می رود. این بستگی به گونة گیاهی خاص ممکن است 4 تا 6 هفته وقت بگیرد. بعد از تشکیل گیاهچة کامل (گیاهان کوچک و جوان)، به گلدان هایی که محتوی مخلوطی از خاک هستند منتقل شده و به مدتی که برای تیمار سخت کردن قبل از انتقال به گلخانه نیاز دارند، در یک محیط کنترل شده قرار داده می شوند .در گلخانه، گیاهان بازرشد یافته برای پایداری فنوتیپ و وراثت پذیری موتاسیون آزمون می شوند. پروسة اصلاح استاندارد را می توان از این به بعد برای الحاق بعدی موتاسیون های جدید به ارقام تثبیت شده بکار گرفت.

غلظت NaCl در محیط جامد به ppm کشت 1# ماه اول در نمک کشت 2# ماه دوم در نمک کشت 3# ماه سوم در نمک کشت 4# ماه هفتم در نمک
0 1253 1344 1253 1344
6400 377 255 1019 541
11800 314 218 762 444
17200 224 148 517 287
22600 189 148 148 393

برای مطالعه روی تحمل NaCl توتون، جست هایی از هر دو کشت متحمل و حساس به NaCl با قرار دادن سلول های کشت سوسپانسیون بر روی محیط بازرشد جامد، بازرشد داده شدند. محیط کشت بازرشد شامل محیط پایة لینسمایر و اسکوگ همراه با 5/0 میلی گرم در لیتر کینتین بود. بازرشد ساقه بطور قابل توجهی بر روی محیط حاوی NaCl کاهش یافته بود. ساقه ها پس از انتقال به محیط مشابه که حاوی 5 یا 10 میلی گرم در لیتر ایندول استیک اسید (IAA) اضافی بود ریشه دار شدند. کاهش سطح نمک های عمده به نصف یا یک دهم نرمال در این سیستم موجب تحریک ریشه دهی نشده است. مجدداً، قدرت ریشه دهی بطور قابل ملاحظه ای در محیط حاوی NaCl کاهش می یابد.
گیاهان بازرشد یافته از ظروف کشت بیرون آورده شده، در خاک کشت شده، و در آزمایشگاه برای چند هفته قبل از انتقال به گلخانه عادت داده می شوند. گرئه گیاهان بکار رفته: (1) گیاهانی که از کشت های حساس به NaCl بازرشد یافتند و توسط محلول عاری از نمک آبیاری شدند، (2) گیاهانی که به عنوان متحمّل به NaCl از کشت های متحمّل به 4/6 گرم در لیتر NaCl انتخاب شدند، در حضور NaCl بازرشد یافته، و با محلول حاوی سطح نمک مشابه آبیاری شدند، (3) گیاهان مشابه گروه 2 ولی باز رشد یافته و ریشه دار شده در محیط عاری از نمک. بذور هر گروه جمع آوری شده و برای بدست آورن نسل F1 کشت شدند. گیاهان F1 در گلدان های 4 اینچ در خاک را کاشته و گروه های گیاهان با آب حاوی غلظت های مختلف نمک از صفر تا 19 گرم در لیتر NaCl آبیاری شدند. وقتی آشکار شد که تحمل کامل بطور قابل ملاحظه ای از تحمل سلول های کشت شده بالاتر بود، غلظت محلول آبیاری از صفر تا 8/32 گرم در لیتر NaCl افزایش داده شد. تصاویر 11 و 12 گیاهان توتون را از گروه 1 (حساس به نمک) و گروه 3 ( متحمل به نمک) بعد از 3 هفته آبیاری با یک محلول 8/32 گرم در لیتر NaCl نشان می دهد.
بذور حاصل از سه گروه گیاهان F1 تا جای ممکن جمع آوری شد. گلدهی و تشکیل دانه نسبتاً از زنده مانی گیاه به NaCl حساس تر هستند، به همین دلیل از همة گیاهان بذر بدست نیامد. بذور حاصل از سه گروه از گیاهان F1 که با محلول بدون نمک آبیاری شده بودند برای بدست آوردن گیاهان F2 کاشته شدند. گروهی از گیاهان F2 تحت استرس نمک در سطوح مختلف مشابه با F1 قرار داده شدند نتایج این آزمایشات پایداری مقاومت به NaCl انتخابی از طریق کشت بافت در گیاهان نسلهای اول و دوم پس از بازرشد را نشان می دهند. چون ما قادر به انتخاب مکرر لاین های سلولی دارای تحمل خودبخودی به NaCl از کشت 107 سلول دیپلوئید هستیم، معتقدیم که مقاومت ناشی از فعالیت یک آلل دارای غالبیت کامل یا غالبیت ناقص می باشد.
برای افزایش بروز موتاسیون ها، القاء موتاسیون می تواند در مرحلة سوسپانسیون سلولی انجام گردد. موتاسیون به شدت به دز عامل موتاسیون زا همانند تیمارهای مختلف قبل و یا بعد از موتاسیون زایی بستگی دارد. بعد از موتاسیون زایی انتخاب برای فنوتیپ های مطلوب به روش مشابه آنچه در مورد موتاسیون های خودبخودی انجام می گرفت صورت می گیرد. متناوباً، القاء موتاسیون می تواند با بازرشد تعداد زیادی از گیاهانی که بعداً موضوع انتخاب خواهند بود دنبال شود. مزیت القاء موتاسیون در کشت سلولی نسبت به القاء آن در بذر این است که چندین فصل اصلاحی برای تثبیت فنوتیپ مورد نیاز نمی باشد. این ناشی از این حقیقت است که غالب گیاهان بازرشدی حاصل از تک سلول هستند و اگر انتخاب در کشت سوسپانسیون انجام گیرد تمام سلول ها حامل فنوتیپ مطلوب خواهند بود. باید متذکّر شد که مشابه با بذر، غالب موتاسیون های القاء شده در کشت سلولی در یک محیط خاص مضر هستند. بنابراین، باید ابتدا قبل از القاء موتاسیون برای یافتن موتاسیون های خودبخودی جستجو صورت گیرد.
سهولت روش اصلاحی کشت بافت برای برای بکارگیری در گیاهان خوراکی موجب بدست آوردن روش های قابل اعتماد برای بازرشد شده است. برای تعدادی از لگوم ها (سویا، لوبیا خشک)، هنوز روش های بازرشد مناسبی ایجاد نشده است. علیرغم این مشکلات، امروزه متدلوژی کاملی برای الحاق اصلاح کشت بافت در برنامه های اصلاحی موجود گندم، چاودار، ذرت، گوجه فرنگی، و جو در اختیار قرار دارد.
یک انتقاد عمومی از روش اصلاحی کشت بافت این است که حتی اگر لاین های سلولی موتانت با صفات تغییر یافته در مرحلة سلولی انتخاب گردد، خصوصیت فنوتیپی آن ممکن است در مراحل مختلف تولید پایداری لازم را نداشته و برای کاربرد در مزرعه مفید نباشد و یا احتمال حمل اثرات نقطه ای مضر نیز در آن وجود دارد. این سؤالات را تنها می توان توسط آزمایشات جواب داد، به هر حال، روش های کشت سلول های گیاهی برای بدست آوردن گیاه کامل موتانت توتون از لاین های سلولی موتانت مقاوم به استرپتومایسین بطور موفقیت آمیزی بکار رفته، و برای سمّیت Pseudonomas tabaci و برای علف کش پیکلرام، مقاومت گیاهان کامل بازرشد یافته باقی مانده و قابل وراثت می باشد. اخیراً همانطوری که قبلاً بحث شد آزمایشگاه ما گیاهان توتون با تحمل بسیار بالا به NaCl از لاین های سلولی موتانت تولید کرد، و آزمون گلخانه ای نشان داد که این صفت به نسل F2 قابل وراثت می باشد.
مهم نیست که منبع موتاسیون کشت بافت باشد یا منابع سنتی، روش های کشت بافت بطور قاطع می توانند زمان مورد نیاز برای نعرفی ارقام جدید به زارعین را کاهش دهند. مثلاً اگر یک گیاه متحمل به خشکی توسط یک اصلاح کننده در مزرعه پیدا شود، دوره ای از چندین سال معمولاً قبل از بدست آوردن مقدار بذر کافی برای معرفی به زارع مورد نیاز می باشد. در حالیکه با کشت بافت، تعداد زیادی از گیاهان را می توان به سرعت در ظرف چند ماه تکثیر کرد.

بهبود سريع گياهان زراعي با استفاده از روش کشت بافت

مطالب مشابه :

دانلود پاورپوینت با موضوع کشت بافت

دانلود جزوه مبانی کشت بافت - دکتر مهدی شاهسوند

تاریخچه کشت سلول

امتزاج پروتوپلاست و كاربرد آن در اصلاح نباتات

سیاهک آشکار Ustilaga tritici

محاسبه بار میکروبی شیر ((Total Count

بهبود سريع گياهان زراعي با استفاده از روش کشت بافت

انواع کشت