آزمونهاي بيولو‍ژيکي آب

آزمونهاي بيولو‍ژيکي آب: آلودگی آب آشامیدنی سبب انتقال بیماری های مختلف در انسان می گردد .این آلودگی ها ممکن است به صورت مستقیم یا به صورت غیر مستقیم وارد بدن شده ودر جوامع مختلف سبب انتقال بیماری های روده ای گردند .آلودگی مدفوعی آب آشامیدنی تنها از طریق دهانی – مدفوعی وارد بدن انسان نمی شود بلکه ممکن است دراثر تماس باآب آلوده به این ارگانیسم درطی استفاده از آن جهت حمام یا مصارف تفریحی وارد بدن شده وایجاد بیماری نمایند .بعضی ازمیکروارگانیسم درصورتی که به تعداد زیادی در قطرات آب ایجاد شده توسط دوش ها سیستم های تهویه مطبوع ویا آبیاری زمین های کشاورزی وجود داشته باشند می توانند از طریق تنفس وارد بدن شده وایجاد عفونت کنند . وجود میکرو ارگانیسم ها در آب آشامیدنی نه تنها از نقطه نظر بهداشتی وایجاد بیماری اهمیت دارد بلکه دربعضی موارد آن ها با تولید سموم مختلف درآب ویا باایجاد مزاحمت هایی درسیستم های آب رسانی وهمچنین با ایجاد طعم و بو در آب سبب مشکلاتی می گردند که شاید از نقطه نظر بهداشت عمومی اهمیت چندانی نداشته باشد . نمونه برداری نکاتی که در نمونه برداری باید در نظر گرفته شود عبارت است از : 1- برای این که کیفیت نمونه مورد نظر در زمان مشخص شود بهتر است نمونه برداری با فواصل زمانی مناسب انجام شود . 2- نقاط نمونه برداری باید طوری انتخاب شود که نمونه های برداشت شده نمایان گر شرایط کلی سیستم باشد . 3- بهتر است جهت نمونه برداری از بطری های شیشه ای سر سمباده ای باحجم (500- 250) استفاده شود از در پوش های فلزی یا پلاستیکی نیز می توان استفاده کرد به شرطی که تحمل درجه حرارت استریلیزاسیون را داشته باشد .بهتر است شیشه ها از جنس سیلیکات یا مواد مقاوم دیگر باشند .در هنگام نمونه برداری این ظروف باید استریل شده باشند . 4- درمورد آبهایی که قبلا" کلرزنی شده اند لازم است برای خنثی کردن کلر اضافی مقداری تیوسولفات 1% به داخل بطری اضافه شود به همین منظور به ازاء هر 100سی سی نمونه 2یا 3 قطره تیو سولفات 1%در داخل بطری نمونه برداری (قبل از استریل شدن ) ریخته می شود . 5- درهنگام نمونه برداری و انتقال نمونه ها باید دقت کافی داشت تا از آلوده شدن نمونه ها جلوگیری شود .برای جلو گیری از تغییرات احتمالی در ترکیبات نمونه ها بهتر است هر چه سریع هر به آزمایشگاه ارسال شود . 6- در هنگام برداشت نمونه بطری نباید کاملا" پر باشد وباید کمی از فضای بالای آن خالی باشد تا در هنگام انجام آزمایش تکان دادن نمونه راحت تر باشد . نکته : برای فاضلاب یک محلول 10%تیوسولفات سدیم درست می کنیم بعد 1/0میلی گرم از این محلول را داخل بطری های 120سی سی می ریزیم ودر پایان نمونه گیری به بطری حاوی نمونه اضافه می کنیم .این مقدار می تواند 15میلی گرم کلر را خنثی کند .برای آب آشامیدنی محلول 3%تیوسولفات سدیم درست می کنیم بعد 1/0میلی گرم از این محلول را به داخل بطری های 120سی سی می ریزیم .این مقدار می تواند 15میلی گرم در لیتر کلر را خنثی کند . اطلاعاتی که باید روی ظرف نمونه باشد شماره ی نمونه ،تاریخ وساعت نمونه برداری ،موقعیت ومحل نمونه برداری ،نام نمونه بردار. نکاتی که در نمونه برداری مهم است 1- نقاط نمونه برداری 2- زمان نمونه برداری 3- تناوب در نمونه برداری 4- حفظ ترکیب نمونه تا زمان انجام آزمایش عوامل موثر درفاصله زمانی نمونه گیری وتعداد نمونه 1- حجم یا گنجایش منبع 2- نوع منبع 3- جمعیت 4- میزان مصرف آب در روز 5- اتفاقات هشدار دهنده اگرجمعیت بین5000تا 100000نفراست به ازای هر 5000نفر یک نمونه در ماه می گیریم . اگرجمعیت کمتر از 5000نفر است یک نمونه در ماه کافی است . اگر جمعیت بیش از 100000نفر است به ازای هر 1000نفر یک نمونه می گیریم و 10 نمونه هم اضافه می گیریم. نحوه ی نمونه برداری از آب برای آزمایش های میکروبیولوژی نمونه برداری از آب شیر : کلیه متعلقات شیر را که ممکن است باعث آلودگی شوند جدا می کنیم وخروجی شیر را بااستفاده ازدستمال تمیزی پاک می کنیم .شیر را تا آخر بازمی کنیم ومی گذاریم 1تا2دقیقه جریان یابد سپس با استفاده از شعله گاز یا پنبه آغشته به الکل شیر را به مدت 1دقیقه استریل می کنیم .شیر را به مدت 1تا2دقیقه با جریان متوسط باز می کنیم یک بطری استریل برمی داریم گره نخ روی کاغذ محافظ را باز می کنیم و درب بطری را برمی داریم . در بطری وپوشش محافظ آن را به سمت پایین نگه می داریم وبطری را فورا"زیر جریان آب می گیریم وپر می کنیم وقسمتی از حجم بطری را خالی نگه می داریم درب بطری را باز نگه می داریم و کاغذ محافظ را روی آن قرار می دهیم و با نخ می بندیم . نمونه برداری از آب یک منبع یا مخزن (رودخانه ،دریاچه،مخزن و...) : درب بطری استریل را به همان طریق که در قسمت قبل گفته شد بر می داریم بطری را از قسمت پایین نگه می داریم و تا عمق 20سانتیمتری آب پایین می بریم سپس به آرامی دهانه بطری رابه طرف بالا می آوریم تا بطری از جریان آب پر شود بطری را از آب خارج می کنیم ،آب اضافی آن را دور می ریزیم وسپس درب بطری را به همان روش ذکر شده می گذاریم . نمونه برداری از یک چاه دستی ومنابع مشابه : قطعه سنگی به اندازه مناسب به وسیله ی یک نخ به یک بطری نمونه برداری متصل می کنیم ، نخ متصل به بطری را به ریسمان تمیزدیگری به طول تقریبی 20متر گره می زنیم ،درب بطری را به روش ذکر شده برمی داریم به کمک قرقره ای که نخ آن پیچیده شده به آرامی بطری را به داخل چاه می فرستیم به طوری که با دیواره ی چاه تماس پیدا نکند ، بطری را تا حد امکان در آب چاه فرو می بریم بعد از پر شدن بطری را با پیچیدن نخ به دور قرقره بطری را بالا می آوریم آب اضافی آن را خارج می کنیم و درب آن را می بندیم . محل نمونه برداری از شبکه توزیع آب بسته به این که سیستم باز یا بسته یا مرکب باشد محل نمونه برداری متفاوت است . درسیستم باز مکان های نمونه برداری عبارتند از : 1- محل خروج آب از منبع اصلی 2- یک نمونه از آب داخل مخزن ونمونه ای از قسمت خروجی مخزن برداشت می شود . 3- شبکه اصلی 4- لوله های فرعی 5- شیر برداشت درسیستم بسته مکان های نمونه برداری عبارتند از : 1- منبع اصلی 2- اگر آب وارد تصفیه خانه می شود وپس از آن وارد شبکه می گردد از ورودی وخروجی تصفیه خانه باید نمونه برداری کرد . 3- شبکه اصلی 4- شبکه فرعی درسیستم مرکب محل های نمونه برداری عبارتند از : 1- فاصله منبع تا تصفیه خانه 2- بعد از تصفیه خانه 3- از داخل تصفیه خانه درصورت وجود مشکل باید نمونه برداری کرد 4- شبکه اصلی 5- شبکه های فرعی 6- شبکه اصلی سیستم باز 7- شبکه فرعی سیستم باز 8- از منابع کمکی محل های نمونه برداری از تصفیه خانه فاضلاب در نمونه برداری از فاضلاب نکته مهم رعایت بهداشت فردی در مواقع نمونه برداری استفاده از دستکش یکبار مصرف وپوشش مناسب در زمان نمونه برداری است . مکان های نمونه برداری از تصفیه خانه فاضلاب عبارتند از : 1- ورودی فاضلاب به تصفیه خانه 2- خروجی پساب 3- نمونه برداری از فرایند های تصفیه خانه ( حوضچه هوادهی ،ته نشینی ) انواع نمونه برداری نمونه گیری لحظه ای ( grab sampling): درحقیقت کیفیت آب را در یک محل و زمان مشخص بیان می کند . نمونه گیری پیوسته : تداوم برداشت نمونه از یک یا چند محل نمونه برداری و انتقال آن ها به ایستگاههای تجزیه کننده ی خود کار را نمونه بردارییوسته گویند که معمولا" درتصفیه خانه ها مورد استفاده قرار می گیرد . نمونه گیری مرکب : برداشت نمونه های متعدد از یک محل در فاصله زمانی مختلف ومخلوط کردن آنها را نمونه برداری مرکب گویند . نگهداری وذخیره نمونه از زمانی که نمونه گرفته می شود تا زمان رسیدن به آزمایشگاه 6ساعت می تواند باشد و2ساعت هم زمان لازم برای انجام آزمایش روی نمونه است . اگر به هر دلیلی موفق به انجام این ساعت نشدیم می توانیم نمونه را در دمای 4درجه سانتیگراد 24ساعت نگهداری کنیم .درضمن حفظ درجه سرما برای نمونه الزامی است ودر هنگام انتقال نمونه باید دمای 10درجه سانتیگراد را همیشه رعایت کرد. شاخص های میکروبی کیفیت آب آب آلوده شده به مدفوع مسئول بیماری های روده ای زیادی می باشد . با وجود این که بیشتر عوامل بیماری زا منتقله توسط آب قابل تشخیص هستند،روش های موجود اغلب مشکل ،پرهزینه وطولانی مدت است .به علاوه عوامل بیماری زاتنها ا ز طریق افراد آلوده وحیوانات وارد آب نمی شوند .و امکان آزمایش آب برای هر پاتوژن احتمالی که ممکن است در آن حضور داشته باشد غیر ممکن است .به همین خاطر باید شاخصی را جهت تشخیص آلودگی مدفوعی آب ،تعیین کرد .باکتری های تعیین شده به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی ،باید به تعداد زیادی در مدفوع انسان وحیوانات خون گرم وجود داشته باشند .از دیگر خواص شاخص این است که آنها باید به آسانی توسط روش های ساده قابل تشخیص باشند . همچنین آنها نباید در آبهای طبیعی رشد کنند .علاوه بر این میزان پایداری آنها وحذف آنها به وسیله ی روش های تصفیه آب مشابه سایر عوامل بیماری زا ی منتقله از آب باشد . شاخص های آلودگی مدفوعی آب کلی فرم ها : از خانواده ی Enterobacteriacea هستند .میله ای شکل، گرم منفی، متحرک ، بدون اسپور،هوازی – بی هوازی اختیاری هستند وتخمیر قند لاکتوز را دارند .اعضای این گروه عبارتند از : 1- اشرشیا کلی 2- سیترو باکتر 3- آنترو باکتر آیروژناز 4- کلبسیلا ازمیان اعضای این گروه فقط اشر شیا کلی خاص مدفوع است .ولی سایر اعضای این گروه می توانند در آب های غنی از مواد آلی مثل فاضلاب های صنعتی یافت شوند . تعداد اشرشیا کلی در مدفوع تازه ی انسان 109به ازای هر گرم مدفوع انسان است . تعداد بقیه ی اعضای این گروه درمدفوع تازه ی انسان 106به ازای هر گرم مدفوع انسان است . درمدفوع تازه ی انسان 106به ازای هر گرم مدفوع انسان است . وجود اشرشیا کلی در آب نشان دهنده ی آلودگی آب با منابع مدفوعی است و این آب قابل شرب نیست . اگر سایر اعضای گروه کلی فرم در آب یافت شد ولی اشرشیا کلی در آب نبود با توجه به استانداردها آب قابل شرب است چون ممکن است این باکتری ها از سایر منابع غیر مدفوعی مثل خاک وارد آب شده باشد . استرپتو کوکوس مدفوعی : عنوان استرپتو کوکوس مدفوعی به آن دسته از استر پتو کوک ها اطلاق می شود که عموما" در مدفوع انسان وحیوانات وجود دارند .همه آنها متعلق به آنتی ژن گروه لنسفیلد می باشند .از نظر طبقه بندی آنها متعلق به دو جنس آنترو کوکوس واسترپتو کوکوس هستند .جنس آنترو کوکوس اخیرا" به کلیه استرپتو کوک که خواص بیو شیمیایی دارند و مقاومت زیادی در شرایط نا مطلوب از نظر رشد از خود نشان می دهند، اطلاق می شود این جنس شامل گونه های آنترو کوکوس آویدن ،آنترو کوکوس کسلیفلاوس، آنترو کوکوس سکوروم ، آنترو کوکوس دورانس، آنترو کوکوس فکالیس ، آنترو کوکوس فاسیوم ،آنترو کوکوس گا لینادیوم ، آنترو کوکوس هیرائه، آنترو کوکوس مالودوراتس، آنترو کوکوس موندتی،آنترو کوکوس سولیتاریس،می باشد . اکثر این گونه ها منشاء مدفوعی دارندوتحت بعضی شرایط به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی انسان مورد توجه قرار می گیرند .آنها ممکن است از مدفوع حیوانات نیز جدا شوند . استرپتو کوک مدفوعی به ندرت در آب آلوده تکثیر می یابد و پایدارتراز اشرشیا کلی و باکتری های کلی فرم است .از این ارگانیسم به عنوان یک شاخص اضافی برای تعیین کار آیی تصفیه استفاده می شود .علاوه بر این استرپتو کوکوس در برابر خشکی بسیار مقاوم است وممکن است برای کنترل مداوم سیستم های شبکه توزیع پس از نصب لوله های اصلی جدید یا تعمیر شده و یا جهت تشخیص آلودگی توسط ریزش های سطحی به داخل آب های زیر زمینی یا آبهای سطحی به کار رود . کلستریدیای احیاکننده ی سولفیت : این گروه،ارگانیسم های اسپورداربی هوازی هستند که مهمترین آنها کلستریدیوم پر فرانژانس (ولشای) است، که بطور معمول تعداد آن درمدفوع کمتر از اشرشیا کلی می باشد (104)این ارگانیسم ها تنها منشا مدفوعی ندارندو می توانند ناشی از سایر منابع محیطی باشند .اسپورهای کلستریدیا مدت طولانی تری از ارگانیسم های کلی فرم در آب باقی می مانند ونسبت به ضد عفونی کننده ها نیز مقاوم تر هستند .حضورآنها درآب های ضد عفونی شده، نشان دهنده ی عدم کارایی سیستم تصفیه است .به ویژه حضور کلستریدیوم پر فرانژنس در آبهای عبوری از صافی ، علامت عدم کارایی صافی ها می باشد .وجود اسپورهای این ارگانیسم درآب می تواند نمایان گر حضور کیست های تک یاخته باشد .وجود آن همچنین نشان دهنده ی آلودگی قدیمی آب است به هر حال آزمایش تعیین کلستریدیوم پر فرانژنس به عنوان آزمایش معمول وروتین توصیه نمی شود .زیرا این ارگانیسم به مدت طولانی درآب باقی می ماند وممکن است آب قبلا آلوده شده باشد . باکتریوفاژها: باکتریوفاژها، ویروسهایی هستند که سلولهای باکتریایی(میزبان) را آلوده می کنند. آنها معمولا از یک مولکول اسید نوکلوئیک (ژنوم) که توسط پوشش پروتئینی (کپسید) احاطه شده تشکیل شده اند. باکتریوفاژها دارایDNA یا RNA هستند. این ارگانیسمها ممکن است دارای ساختمان بسیار ساده مکعبی و یا بسیار پیچیده با سر و دم، فیبرهای دم وغیره باشند. اندازه آنها بین 25 تا100 نانومتر است. باکتریوفاژها به دلیل طبیعت مشابهی که دارند و همچنین به دلیل این که تشخیص آنها در نمونه های آبی نسبتا ساده است به ویژه در آبی که احتمال آلودگی به ویروسهای روده ای انسان در آن است به عنوان شاخص کیفی آب به کار می روند. به علاوه اطلاعاتی در رابطه با تشابه بین گروههای معین باکتریوفاژها و ویروسهای روده ای انسان در زنده ماندن آنها در محیط های آبی و فرآیندهای تصفیه آب و فاضلاب به دست آمده است. دو گروه باکتریوفاژها که مطالعات وسیعی روی آنها به عنوان شاخص ویروسی آب انجام شده است عبارتند از: کلی فاژهای طبیعی(سوماتیک) که گونه های میزبان اشرشیاکلی استاندارد را آلوده می کند و باکتریوفاژهایF-Specific RNA که اشرشیاکلی و باکتریهای وابسته به آن را آلوده می کند. هیچ کدام از این گروهها به تعداد زیادی در مدفوع دیده نمی شود اما در فاضلاب به طور ثابت دیده می شوند. بنابراین آنها ابتدا به عنوان شاخص آلودگی به فاضلاب و سپس به دلیل پایداری بالای آن در مقایسه با شاخصهای باکتریای به عنوان شاخص ثانویه کارایی تصفیه و یا حفاظت آب زیرزمینی به کار می روند. شاخص های متفرقه: گروه بیفیدوباکترها، باکتروئوس فراژیلیس، باکتریهای بی هوازی هستند که به تعداد بیشتری نسبت به کلی فرمها در مدفوع یافت می شوند. آنها در آبهای طبیعی زنده نمانده و یا تکثیر نمی یابند و در نواحی استوایی و شبه استوایی دیده شده اند. این باکتریها در این گونه آبهای گرم و همچنین آبهای غنی با موادآلی می توانند تکثیر یابند. این باکتریها در آبهای آلوده و فاضلاب سریعتر از اشرشیاکلی و کلی فرمهای مقاوم در برابر حرارت از بین می روند سرعت تجزیه آنها بیش از سایر شاخصهای باکتریایی می باشد این مسئله یکی از معایب این ارگانیسمها است. زیرا خود کلی فرمها نیز حساستر از عوامل بیماریزای تک یاخته و ویروسی هستند. به علاوه روشهای تشخیص آنها در آب خیلی ساده نبوده و روش استانداردی برای تعیین آنها وجود ندارد. کیفیت باکتریولوژیکی آب حضورکلی فرم در آبهای سطحی مشخص کننده ی آبودگی آن توسط یک یا ترکیبی از سه منبع فضولات انسان، حیوان و یا آلودگی ناشی از خاک است. حد استاندارد تعداد کلی فرم برای تماس بدن با آب جهت مصارف تفریحی حدود200 کلی فرم مدفوعی در100ml و1000 کلی فرم در100ml است. برطبق درجه آلودگی باکتریایی آب، آب خام را به چهاردسته تقسیم می کنند که در جدول زیر آمده است.(1) کلی فرم در100ml کلی فرم مدفوعی در100ml استرپتوکوک مدفوعی در100ml آلودگی باکتریایی که از طریق ضدعفونی کردن برطرف می شود. 50 20 20 آلودگی باکتریایی که نیاز به روشهای پی درپی(انعقاد،ضدعفونی کردن وصاف کردن) دارد. 5000 2000 1000 آلودگی زیاد که با روشهای تصفیه پرخرج برطرف می شود. 50000-5000 20000-2000 بیش از1000 آلودگی خیلی بالای آب که غیرقابل قبول است. بیش از50000 بیش از20000 بیش از1000 استاندارد های کیفیت باکتریولوژیکی آب آشامیدنی استانداردهای کیفیت باکتریولوژیکی آب آشامیدنی بر اساس رهنمودهای سازمان جهانی بهداشت ارگانیسم مرحله ذخیره سازی MPN/100ml مجموع کلی فرم آب تصفیه شده ورودی به سیستم توزیع 0 کلی فرم مدفوعی 0 مجموع کلی فرم آب تصفیه شده در داخل سیستم توزیع 3 کلی فرم مدفوعی 0 جدول شماره 1- استانداردهای کیفیت باکتریولوژیکی آب آشامیدنی در اروپا ارگانیسم مرحله ذخیره سازی MF/100ml MPN/100ml مجموع کلی فرم در سیستم توزیع 0 کلی فرم مدفوعی در سیستم توزیع 0 استرپتوکوکوس مدفوعی در سیستم توزیع 0 کلستردیوم پرفرانژانس در سیستم توزیع 0 جدول شماره 2- استانداردهای کیفیت باکتریولوژیکی آب آشامیدنی بر اساس رهنمودهای سازمان حفاظت محیط زیست آمریکا ارگانیسم حد رهنمود حداکثر مجاز کریپتوسپوریوم 0 99 ژیاردیا لامبلیا 0 99.9 لژیونلا 0 - ویروس(روده ای) 0 99.99 مجموع کلی فرم 0 95 کلی فرم مدفوعی 0 100 بشقابی هتروتروف 0 500CFU/ml کدورت 0.5NTU 1NTU استانداردهای کیفیت باکتریولوژیکی آب آشامیدنی در ایران نوع منبع مرحله ذخیره سازی ارگانیسم MPN/100ml Piped water آب تصفیه شده ورودی به سیستم توزیع TC 0 (98%) FC 0 آب تصفیه شده درداخل سیستم توزیع TC 0 (95%) FC 0 Non piped water TC 10 FC 0 Emergency water supplies TC 0 FC 0 روش های آزمایشات باکتریولوژیکی آب روشهای متعددی برای آزمایش باکتریولوژیکی آب وجود دارد که عبارتند از: 1- روش تخمیر چند لوله ای Multiple-tube Fermentation Technical 2- روش شمارش بشقابی Plate Count Method آزمایش Heterotrophic Plate Count باكتريهاي هتروتروف گروهي ميكروارگانيسم هستند كه قادر به سنتز همه مواد مغذي مورد نياز خود نمي باشند و لذا به منابع خارجي مواد آلي و غير آلي جهت تغذيه وابسته مي باشند. تعداد قابل توجهي از باكتريهايي كه در سيستم هاي آب آشاميدني مي باشند از جمله باكتريهاي هتروتروف مي باشند. باكتريهاي هتروتروف مجموعه اي از باكتريهاي هوازي و بيهوازي اختياري هستند كه به جز دو جنس آن باسيلوس و ميكروكوكوس گرم منفي بوده و جنس هاي پروتئوس ، انتروباكتر ،آئروموناس ، سيتروباكتر ، سودوموناس ، كلبسيلا ، فلاوباكتريوم ، سراشيا ، موراكسلا ، الكالي ژنز و آسينتوباكتر را شامل مي شوند. جنس هاي غالب اين مجموعه، باكتريهاي سودوموناس، سراشيا، انتروباكتر، فلاوباكتريوم و آسينتوباكتر هستند . علاوه بر جنس هاي ياد شده، برخي از باكتريهاي مهم در پزشكي نظير: مايكوباكتريوم ، استافيلوكوكوس و سراشيا نيز در تركيب باكتريهاي هتروتروف ممكن است حضور داشته باشند. باكتريهاي هتروتروف ساكن طبيعي بدن انسان و حيوانات بوده و از طريق مدفوع دفع مي شوند. برگ درختان ، خاك ، آب ، قطره هاي باران و حتي بزاق دهان نيز تعداد متنابهي از اين باكتريها را در خود جاي داده اند. هر اينچ مربع از پوست سالم انسان، ميزبان صدها هزار باكتري هتروتروف است. اين باكتريها در بستر هاي كربن فعال، رزين ها، صافي هاي ماسه اي و غشايي ، شبكه هاي توزيع و اجزاي آن، خنك كننده ها، مخازن تحت فشار و حتي جدار بطري هاي آب وجود دارند. بعضي از اعضاي اين گروه ، مانند سودوموناس ، آئروموناس ، كلبسيلا ، فلا ووباكتريوم ، انتروباكتر ، سيتروباكتر، سراشيا، اسينتوباكتر و پروتئوس از جمله پاتوژنهاي فرصت طلب بوده و جمعيت خاصي چون نوزادان و افراد مسن و بيمار را در معرض خطر عفونت قرار مي دهد. اما در مورد تأثيرات تعداد زياد باكتريهاي HPC روي سلامتي انسان اطلاعات اندكي در دسترس مي باشد. تعداد كلني هاي باكتريايي داخل يا روي محيط هاي جامد حاوي تركيبات آلي نظير منابع انرژي و كربن اطلاعاتي را درمورد غلظت و تراكم باكتريهاي هتروتروفيك قابل كشت در آب و يا ديگر محيط هاي مورد بررسي به ما مي دهد. اين مورد به عنوان شمارش بشقابي هتروتروفيك (HPC) خوانده مي شود كه در ابتدا توسط كخ در سال 1881 مورد استفاده قرار گرفت و اولين ابزار نشان دهندة كيفيت ميكروبي آب (تصفيه شده ) بود. چند سال بعد اين روش در تعدادي از كشورهاي اروپايي به كار گرفته شد. در آغاز قرن بيستم روش ها و محيط هاي متعددي جهت تشخيص شاخص هاي باكتريايي مدفوعي ابداع شد. اما شيوع كريپتوسپوريديوزيس ميلواكي در سال 1993 مشخص نمود كه عدم وجود كليفرمها هميشه نمي تواند بيانگر اطمينان از سلامت ميكروبي آب باشد. مقادير HPC مي تواند اطلاعاتي را در مورد ميزان فعاليت ميكروبي در آب ارائه نمايد و بنابراين مي تواند جهت كنترل و بهينه سازي فرآيندهاي تصفيه و روشها و فعاليتهاي مهندسي مربوط به تصفيه و توزيع به كار رود. HPC را نمي توان به عنوان يك شاخص در شناخت نوع ميكروارگانيسم موجود به كار برد. در ضمن نتايج HPC يك ارزيابي دقيق از تراكم و غلظت كل باكتريهاي هتروتروف نمي باشد و نتايج آن مي تواند بيانگر ارگانيسم هاي قابل كشت موجود باشد. تركيب و تراكم گونه هاي باكتريايي كه در آزمايش HPC بازيابي مي شوند متفاوت بوده و به فاكتورهاي متعددي از جمله مشخصات فيزيكي و شيميايي آب بستگي دارد. اختلاف در شمارش و نوع ارگانيسم هاي موجود در نمونه هاي يكسان از يك مكان نيز به وقوع مي پيوندد. ميكروارگانيسم هاي بازيابي شده در تست HPC مي تواند شامل ارگانيسم هايي باشد كه به طور طبيعي در آب و محيط وجود دارند و يا ارگانيسم هايي كه از منابع آلاينده مختلف وارد مي شوند. در آبهاي آشاميدني تعداد باكتريهاي HPC ممكن است كمتر از CFU 1 تا بيش از CFU 104 در ميلي ليتر متغير باشد و عمدتاً متأثر از درجه حرارت ، وجود كلر باقيمانده و ميزان مواد آلي قابل جذب مي باشند. ميزان HPC نبايد از 500 ارگانيسم در ميلي ليتر بيشتر باشد. با توجه به موارد زير، HPC جهت اپراتورهاي واحدهاي تصفيه آب مفيد مي باشد. 1- ارزيابي كارايي فرآيندهاي مختلف تصفيه ، از جمله گندزدايي، در يك واحد تصفيه آب 2- پايش كيفيت بيولوژيكي آب خروجي از تصفيه خانه در طي ذخيره و توزيع آن 3- تعيين رشد باكتريايي روي سطوح مواد مورد استفاده در سيستمهاي تصفيه و توزيع 4- تعيين قابليت رشد مجدد يا رشد بعدي در آب تصفيه شده در سيستم هاي توزيع به طور كلي تعداد شمارش شدة باكتريهاي هتروتروف به نوع محيط كشت ، زمان و دماي انكوباسيون و سرانجام روش كشت آن ها وابسته بوده و با افزايش دما و زمان انكوباسيون تعداد شمارش دهندة آن ها افزايش مي يابد. كربن آلي قابل جذب (AOC ) به ويژه در غلظت هاي بيش از 15 ميكروگرم در ليتر، باقيمانده عامل گندزدا در آب، جنس شبكه، دما، كدورت و تعداد اوليه باكتريهايي كه از طريق تصفيه خانه وارد شبكه مي شوند عامل هاي اثرگذار بر نرخ رشد جمعيت ميكروبي در خطوط آبرساني محسوب مي شوند. انجمن كارهاي آبي ايالات متحده (AWWA) شرايط مناسب براي رشد باكتريهاي هتروتروف را در مقادير بيش از 50 ميكروگرم در ليتر AOC ، دماي بالاتر از 10 درجه سانتيگراد و كلر باقيمانده آزاد كمتر از 2/0 ميلي گرم در ليتر دانسته است . بر طبق اعلام سازمان حفاظت محيط زيست ايالات متحده (EPA) حداكثر تعداد مجاز HPC در شبكه توزيع CFU/100ml 500 است و در صورتي كه اين مقدار به 1500 كلني در هر ميلي ليتر فزوني يابد، نشانة نقص در تأسيسات آبرساني و به احتمال نياز به شستشوي شبكه و مخزن است. برای انجام آزمایش Heterotrophic Plate Count از سه روش و چهار نوع محیط کشت استفاده می شود. روش های انجام آزمایش Heterotrophic Plate Count 1- Pour Plate Method 2- Spread Plate Method 3- Membran Filter Method محیط کشت های مورد استفاده در آزمایش Heterotrophic Plate Count 1- Plate Count Agar(Trypton Golucose Yeast Agar) 2- m.Hpc Agar 3- R2A Agar 4- NWRI Agar Plate Count Agar: این محیط کشت از مواد زیر تشکیل شده است: 1-agar 9gr/l 2-dextrose 1gr/l 3-tryptone 5gr/l 4-yeast extract 2.5gr/l pH= 7±0.2 این محیط کشت برای دو روش Pour Plate Methodو Spread Plate Method استفاده می شود. این محیط کشت جز محیط کشتهای high nutrient می باشد با این وجود تعداد کلنی های شمارش شده با این محیط کمتر از محیط های کشت R2A Agar و NWRI Agar است. این محیط کشت را پس از تهیه در اندازه های12-15cc در لوله های آزمایش می ریزند و در اتوکلاو121˚c به مدت 15-12 دقیقه استریل می کنند. m.Hpc Agar : این محیط کشت برای روش Membran Filter Method استفاده می شود. این محیط کشت جز محیط کشتهای high nutrientاست با این وجود تعداد کلنی های شمارش شده با این محیط کمتر از محیط های کشت R2A Agar و NWRI Agar است. pH= 7.1 R2A Agar : این محیط کشت از مواد زیر تشکیل شده است: 1-protese peptone 0.5gr 2-casamino acide 0.5gr 3-yeast extract 0.5gr 4-glucose 0.5gr 5-soluble starch 0.5gr 6-dipotassium phosphate 0.3gr 7-magnesium sulfate 7H2O 0.05gr 8-sodium pyruvate 0.3gr 9-agar 15gr pH= 7.2 این محیط کشت برای روشهای Pour Plate Methodو Spread Plate Method و Membran Filter Method استفاده می شود. این محیط کشت جز محیط کشتهای low nutrient می باشد ولی تعداد کلنی های شمارش شده با این محیط کشت بیشتر از محیط کشتهای Plate Count Agar و m.Hpc Agarاست. برای ساخت این محیط کشت پس از محاسبه حجم لازم ، مقدار مورد نیاز از پودر R2A Agarرا برداشته و در حجم مورد نیاز از آب رقیق سازی حل می کنیم ( پودر را باید کم کم به آب رقیق سازی اضافه کرد تا خوب در آب حل شود وگلوله نشود) سپس محلول آماده شده را روی شعله قرار داده و تا رسیدن به نقطه جوش حرارت می دهیم تا یک محلول یکنواخت حاصل شود (در حین حرارت دادن باید محلول را مرتبا با تکان دادن ظرف حاوی محلول هم زد تا ته نگیرد) سپس برای آزمایش Pour Plate Method 12cc از محیط کشت آماده شده را در لوله های آزمایش ریخته و دراتوکلاو 121˚c به مدت 15-12 دقیقه استریل می کنیم و برای آزمایش Membran Filter Method ابتدا محیط کشت را دراتوکلاو 121˚c به مدت 15-12 دقیقه استریل کرده و سپس با حفظ شرایط استریل (در کنار شعله) 10cc از محیط کشت آماده شده را در plate می ریزیم. NWRI Agar : این محیط کشت برای روشهای Pour Plate Methodو Spread Plate Method و Membran Filter Method استفاده می شود. این محیط کشت جز محیط کشتهای low nutrient می باشد ولی تعداد کلنی های شمارش شده با این محیط کشت بیشتر از محیط کشتهای Plate Count Agar و m.Hpc Agarاست. از معایب این محیط کشت که استفاده از آن را محدود کرده است این است که این محیط کشت به صورت تجاری وجود ندارد و باید آن را از مواد اولیه اش ساخت که این مسئله می تواند نتایج نهایی را با خطا همراه کند. این محیط کشت از مواد زیر ساخته می شود: 1-peptone 3gr 2-soluble casein 0.5gr 3-K2HPO4 0.2gr 4-MgSO4 0.05gr 5-FeCl3 0.001gr 6-agar 15gr 7-reagent-grade water 1lit روش Pour Plate Method روش تراوشی از لحاظ اجرا ساده است و می تواند حجم هایی از نمونه یا نمونه رقیق شده از 0.1 تا 2 میلی لیتر را مورد بررسی قرار دهد. کلنی هایی تولید شده در این روش نسبتا کوچک و فشرده هستند. در این روش ممکن است در نتیجه ی در معرض قرار گرفتن سریع نمونه با آگار(محیط کشت) 45-46˚c شوک حرارتی به باکتریها وارد شود. همچنین در این روش ممکن است کلنی ها در محیط کشت فروروند که این امر انتقال آنها را با مشکل مواجه می کند. برای انجام این روش ابتدا رقتهای مورد نیاز را تهیه می کنیم سپس نمونه را 25 بار تکان می دهیم یا 15-20 ثانیه روی shaker قرار می دهیم سپس به وسیله یک پیپت استریل و در مجاورت شعله 1cc نمونه برمی داریم در plate را کمی باز می کنیم و با زاویه 45˚ پیپت را وارد plate کرده و در یک سمت plate نمونه را می ریزیم سپس محیط کشت که دمای آن 44.5˚c است از بن ماری خارج کرده (محیط کشت را پس از ساخت حداکثر تا 3 ساعت می توان در بن ماری نگهداری کرد.) و در سمت دیگر plate می ریزیم ( از زمانی که نمونه را می ریزیم تا وقتی که محیط کشت را می ریزیم ماکزیمم 20 دقیقه فرصت داریم چون در زمانهای بیش از این باکتریها لیز می شوند.) و plate را به صورت 8 حرکت می دهیم تا محیط کشت یکنواخت پخش شود بعد plate را روی یک سطح صاف قرار می دهیم تا محیط کشت سرد و جامد شود سپس پشت plateمشخصات مورد نیاز نظیر رقت نمونه، تاریخ انجام آزمایش و نام فرد آزمایش کننده را یادداشت کرده و آن را وارونه در انکوباتور 35˚c به مدت 48 ساعت قرار می دهیم اما اگر بخواهیم بیشترین شمارش را داشته باشیم plate را در انکوباتور 20-28˚c به مدت 7-5 روز قرار می دهیم. Plate ها را طوری در انکوباتور می چینیم که هوا بتواند در بین plate ها حرکت کند. باید دقت کنیم که در طول انکوباسیون نمونه ها نباید بیش از 15% رطوبتشان را از دست دهند برای این منظور یک ظرف آب را در انکوباتور قرار می دهیم یا این که plate را داخل پلاستیک قرار می دهیم. بلافاصله بعد از خروج plate ها از انکوباتور، شمارش کلنی ها را انجام می دهیم و اگر مجبور شدیم شمارش را به تاخیر بیاندازیم plate ها را در یخچال به مدت حداکثر 24 ساعت نگهداری می کنیم. برای شمارش کلنی ها از colony counter استفاده و به روش زیر عمل می کنیم: اگر هیچ کلنی روی plate رشد نکرده بود = CFU/ml بیشترین حجم نمونه اگر تعداد کلنی ها کمتر از 30 عدد باشد. تعداد کلنی های شمارش شده= CFU/ml حجم واقعی نمونه در plate اگر تعداد کلنی ها بین 30 تا 300 باشد باید تمام کلنی های روی plate را شمارش کنیم که در این صورت اگر رشد کلنی ها در سطح plate یکنواخت باشد نصف plate را شمارش می کنیم و تعداد بدست آمده را در 2 ضرب می کنیم ولی اگر رشد کلنی ها در سطح plate یکنواخت نباشد باید تمام plate شمارش شود. اگر تعداد کلنی ها بیشتر از 300 عدد باشد باید از یکی از سه روش زیر استفاده کرد: 1- اگر تعداد کلنی ها در هر سانتیمترمربع از سطح plate کمتر از 10 عدد باشد که در این صورت 13 مربع را انتخاب می کنیم (7 مربع افقی و 6 مربع عمودی) تعداد کلنی های 13 مربع را با هم جمع می کنیم و در خارج قسمت 13/ سطح plate ضرب می کنیم. 2- اگر تعداد کلنی ها در هر سانتیمترمربع از سطح plate بیشتر از 10 و کمتر از 100 عدد باشد در این صورت 4 مربع( ترجیحا از چهار قسمت plate ) انتخاب می کنیم، تعداد کلنی های این 4 مربع را شمارش کرده و میانگین می گیریم سپس میانگین کلنی های 4 مربع را در سطح plate ضرب می کنیم. 3- اگر تعداد کلنی ها در هر سانتیمترمربع از سطح plate از 100 عدد باشد. 100 × سطح plate = CFU/ml کمترین حجم نمونه نتایج بدست آمده از انجام آزمایش برای انجام این آزمایش از دانشکده بهداشت سالن شهید علوی، طبقه اول، سرویس بهداشتی، شیر سمت راست نمونه برداری انجام شد. 0.1ml :رقت مورد آزمایش با توجه به این که تعداد کلنی های رشد کرده روی plate بیشتر از 300 عدد مشاهده شد و در هر سانتی مترمربع از سطح plate بین 100-10کلنی وجود داشت، 4 مربع از نقاط مختلف plate انتخاب و شمارش شد که نتایج 20 و23 و43 و38بدست آمد. 20150 =65×31 31=20+23+43+38 0.1 4 بنابراین نتیجه بدست آمده از انجام این آزمایش به صورت زیر است: 20150 CFU/ml Pour Plate,R2A agar,35ºc,48h تفسیر نتایج شماره گروه محل نمونه برداری نتایج آزمایش CFU/ml 1 دانشکده بهداشت ، سالن شهید علوی ، انبار آزمایشگاه شیمی 365 2 دانشکده بهداشت، سالن شهید علوی، طبقه اول، سرویس بهداشتی، شیر سمت راست 20150 3 دانشکده بهداشت،سرویس بهداشتی خواهران (محوطه)، شیر سوم 1800 4 دانشکده بهداشت، سالن شهید علوی ،سرویس بهداشتی خواهران کنار آزمایشگاه شیمی 10> 5 دانشکده بهداشت، سالن شهید علوی، طبقه دوم، سرویس بهداشتی، شیر سمت راست 34850 6 دانشکده بهداشت، سالن شهید علوی، آزمایشگاه شیمی 8700 7 دانشکده بهداشت، سالن شهیدزینال زاده دستشویی روبروی آزمایشگاه میکروبیولوژی 780 با توجه به جدول شماره 2 که استاندارد شمارش بشقابی را بین 0-500CFU/ml بیان می کند و جدول فوق الذکر باید گفت که نمونه های برداشتی گروه های 1و4 از لحاظ بهداشتی در وضعیت مطلوبی قرار دارند و از لحاظ باکتریهای هتروتروف آلودگی ندارند. چون باكتريهاي هتروتروف ساكن طبيعي بدن انسان و حيوانات بوده و از طريق مدفوع دفع مي شوند نشان دهنده آلودگی مدفوعی هستند بنابراین نمونه های برداشتی گروه های 1و4 به مدفوع آلوده نیست. اما نتایج گروهای دیگر آلودگی نشان می دهد که این می تواند ناشی از خطای نمونه بردار، خطای آزمایشگر، نقص در تصفیه آب، فرسودگی و آلودگی شیرهای مورد نمونه برداری باشد. Membran Filter Method : در این روش حجم نمونه بستگی به بار آلودگی نمونه دارد. حجم استاندارد نمونه 100cc باشد ولی می توان حجم های بیشتر را هم آزمایش کرد مثلا برای آب آشامیدنی تا یک لیتر نمونه هم قابل آزمایش است ( یعنی 4 تا صافی که از هر کدام 250cc نمونه عبور داده شده). حجم نمونه برای روش MF برحسب منبع آب بر طبق جدول زیر است: منبع آب 100 50 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 آشامیدنی * استخر * نهر،چاه * * * دریاچه * * * منبع اصلی آب * * * ساحل شنا * * * رودخانه * * * * فاضلاب کلرزنی شده * * * * فاضلاب * * * * معایب روش MF به شرح زیر است: 1- هزینه گران صافی ها 2- بار میکروبی نمونه مورد آزمایش با این روش باید کم باشد به طوریکه بار میکروبی نمونه خروجی از صافی 200-20 باشد. 3- کدورت نمونه مورد آزمایش با این روش نباید زیاد باشد چون باعث گرفتگی صافی می شود. 4- چون منافذ فیلتر کوچک است(0.45 میکرون) برای عبور نمونه نیاز به پمپ خلا داریم که شرایط خلا می تواند روی صافی فشار وارد بیاورد و باعث خرابی صافی و خطا در نتایج بدست آمده شود. آزمایش MF برای شمارش باکتریهای هتروتروف و Total Coliform موجود در نمونه انجام می شود. برای انجام این آزمایش به یک ارلن که به پمپ خلا وصل می شود ، صافی که قطر آن47mm و قطر منافذ آن 0.45 میکرون است و 70% آن دارای منافذ است(توصیه می شود از صافیهای مدرج استفاده شود. در روش MF صافیها برحسب میلیمتر مدرج شده اند.) ، قیف، گیره که تجهیزات را به هم وصل می کند، پنس و سیلندر و همچنین plate حاوی محیط کشت نیاز است ( تمام وسایل مورد نیاز برای این آزمایش را داخل ورقه آلومینیومی می پیچند و در داخل فور یا اون استریل می کنند.). محیط کشت مورد نیاز آزمایش MF برای باکتریهای هتروتروف R2A agar یاm-Hpc agar است و محیط کشت مورد نیاز آزمایش MF برای Total Coliform ، Les Endo agar است. اگر محیط کشت مایع باشد از pad یا تشکهای جاذب استفاده می کنیم توصیه می شود از pad هایی با قطر تقریبا 48mm و ضخامت کافی که 1.8-2.2ml از محیط کشت را جذب کند استفاده می کنیم. برای انجام آزمایش MF برای باکتریهای هتروتروف با حفظ شرایط استریل و با کمک پنس استریل صافی را در محل خود قرار می دهیم و سپس وسایل را به کمک گیره ثابت کرده و به وسیله سیلندر استریل حجم مشخص نمونه را برمی داریم و داخل محفظه دستگاه می ریزیم سپس پمپ را روشن می کنیم تا نمونه از روی صافی رد شود( به محض رد شدن تمام نمونه از صافی، پمپ را خاموش می کنیم تا صافی آسیب نبیند.) سپس پمپ را خاموش کرده، گیره را باز می کنیم و با کمک پنس صافی را برداشته و در plate که حاوی محیط کشت است قرار می دهیم(plate ها در روشMF کوچکتر از plate ها در روش Pour Plate است.) بعد plate را داخل انکوباتور 35˚c به مدت 24 ساعت قرار می دهیم، بعد از 24 ساعت plate ها را از انکوباتور خارج کرده و کلنی های تشکیل شده روی plate را شمارش می کنیم. برای شمارش باکتریها به روش زیر عمل می کنیم: اگر تعداد کلنی ها در هر مربع(mm2 از صافی) کمتر یا مساوی 2 باشد تمام صافی را شمارش می کنیم. اگر تعداد کلنی ها در هر مربع 10-3 باشد،کلنی های 10 مربع را شمارش می کنیم و میانگین می گیریم سپس میانگین تعداد کلنی های 10 مربع را در100 ضرب کرده وبرحجم نمونه تقسیم می کنیم. اگر تعداد کلنی ها در هر مربع 20-10 باشد، کلنی های 5 مربع را شمارش می کنیم و میانگین می گیریم سپس میانگین تعداد کلنی های 5 مربع را در100 ضرب کرده وبرحجم نمونه تقسیم می کنیم. اگر تعداد کلنی ها در هر مربع از 20 بیشتر باشد. CFU/ml = > 2000 حجم نمونه اعتبار آماری نتایج صافی غشایی اگر چه دقت آزمایش MF ازدقت روش MPN بیشتر است شمارش صافی های غشایی ممکن است تعداد باکتری های کلی فرم را کم تخمین بزند بنابر این از حدوداطمینان % 95 استفاده می کنیم .این مقادیر بر پایه ی این فرضیه است که باکتری ها به طور تصادفی پخش شده اند . برای نتایج حاصل از شمارش (C ) بیش از 20 میکروارگانیسم ، حدود اطمینان % 95تقریبی را با استفاده از معادلات زیر محاسبه می کنیم . C √ 2 C + حد بالا C √ 2 -C حدپایین نتایج بدست آمده از انجام آزمایش با توجه به این که تعداد کلنی رشد کرده در هر mm2 از سطح plate بیشتر از 20 بوده و حجم نمونه مورد آزمایش 50ml می باشد به طریق زیر محاسبات انجام گردید: 20×100 = >40 50 بنابراین نتیجه بدست آمده از انجام این آزمایش به صورت زیر می باشد: >40CFU/100ml Membrane filter,R2A agar, 35ºc,24h تفسیر نتایج شماره گروه نتایج آزمایش CFU/100ml 1 4 2 >40 3 >40 4 11 5 >40 6 >40 7 >40 با توجه به جدول شماره 2 که استاندارد شمارش بشقابی را بین 0-500CFU/ml بیان می کند و جدول فوق الذکر باید گفت که نمونه های برداشتی تمامی گروه ها از لحاظ بهداشتی در وضعیت مطلوبی قرار دارند و از لحاظ باکتریهای هتروتروف آلودگی ندارند. چون باكتريهاي هتروتروف ساكن طبيعي بدن انسان و حيوانات بوده و از طريق مدفوع دفع مي شوند نشان دهنده آلودگی مدفوعی هستند بنابراین نمونه های تمامی گروه ها آلودگی مدفوعی ندارد. روش چند لوله ای تخمیر برای شناسایی استرپتوکوکوس و آنتروکوکوس گروه استرپتوکوکهای مدفوعی مرکب از کونه های جنس استرپتوکوکوس از قبیل S.avium ، S.bovis ، S.faecalis ، S.faecium وS.gallinarum می باشد. این باکتریها با آنتی سرمهای گروهD لانسفیلد واکنش مثبت نشان می دهند. زیستگاه طبیعی این استرپتوکوکها، روده انسان و حیوانات خونگرم است. تصور می شد که گونه های S.faecalis ، S.faecium بیشتر از دیگر گونه های استرپتوکوکها به انسان اختصاص داشته باشد که البته گونه های استرپتوکوکهای دیگری نیز به تعداد کمتر در مدفوع انسان مشاهده شده است به طور مثال گونه های S.aviumو S.bovis و S.equinus محدود به حیوانات نیستند، گرچه به طورمعمول در مدفوع حیوانات با تراکم بیشتری وجود دارند. گونه های معینی از استرپتوکوکها در برخی گونه های حیوانی غالب هستند ولی نمی توان منبع آلودگی مدفوعی رابراساس اختصاصی بودن استرپتوکوکهای مدفوعی تعیین نمود. استرپتوکوکهای مدفوعی به همراه کلی فرم های مدفوعی، آلودگی مدفوعی انسان رااز سایر حیوانات خونگرم متمایز می کنند. از روی نسبت کلی فرم های مدفوعی به استرپتوکوکهای مدفوعی می توان به منبع آلودگی پی برد اگر این نسبت بزرگتر یا مساوی 4 باشد نشان دهنده آلودگی آب با مدفوع انسانی است، اگر این نسبت 4-2 باشد در یک آلودگی مختلط با مدفوع انسان و حیوان برتری بیشتر با مدفوع انسانی است، اگر این نسبت 1-0.7 باشد در یک آلودگی مختلط با مدفوع انسان و حیوان برتری بیشتر با مدفوع حیوانی است و اگر این نسبت کمتر از0.7 باشد نشان دهنده آلودگی آب با مدفوع غیرانسانی است. در مورد نمونه های آب وقتی Total Coliform مثبت و Fecal Coliform منفی است آزمایش فکال استرپتوکوک انجام می شود چون استرپتوکوکها نسبت به کلی فرم ها نسبت به شرایط محیطی مقاوم ترند ( ممکن است شرایطی ایجاد شود که کلی فرم ها از بین بروند ولی استرپتوکوکها به دلیل مقاومت بالا از بین نروند.) در این شرایط اگر فکال استرپتوکوک منفی باشد آب آلودگی غیرمدفوعی و اگر فکال استرپتوکوک مثبت باشد آب آلودگی مدفوعی دارد. گروه آنتروکوکها، زیرگروهی از استرپتوکوکهای مدفوعی می باشند که گونه های S.faecalis ، S.faecium وS.gallinarumو S.avium را در برمی گیرند. آنتروکوکها، با توانایی رشد در NaCl 6.5% و در pH 9.6 و دمای10˚c و45˚c از سایر استرپتوکوکها متمایز می شوند. آنتروکوکها شاخص باکتریایی مهمی در تعیین آلودگی آبهای سطحی هستند. پیشنهاد شده است که تعیین کیفیت آب در مورد آبهای recreational براساس تراکم آنتروکوکها انجام شود. برای آبهای تازه استاندارد33 آنتروکوک در100ml و برای آب دریا35 آنتروکوک در100ml در نظر گرفته شده است. (2) برای شناسایی باکتریهای گروه استرپتوکوک از دو روش Membran Filter وتخمیر چند لوله ای استفاده می شود( روش تخمیر چند لوله ای برای شمارش آنتروکوکها برای آبهای خام، کلرزده و همچنین برای آبهای تازه و دریاها نیز می تواند به کار رود ولی برای آبهایی با کدورت بالا مناسب نیست.) روش چند لوله ای تخمیر برای شناسایی استرپتوکوکها و آنتروکوکها شامل دو مرحله احتمالی و تاییدی است. مرحله احتمالی: محیط کشت مورد استفاده در این مرحله آزاید دکستروز براث است. این محیط کشت از مواد زیر تشکیل شده است: 1-beef extract 4.5gr 2-tryptone or polypeptone 15gr 3-glucose 7.5gr 4- NaCl 7.5gr 5-NaN3 0.2gr 6-reagent-grade water 1lit برای ساخت این محیط کشت، 35 گرم پودر آزاید دکستروز براث را در یک لیتر آب مقطر حل می کنیم (حجم محیط کشت مورد نیاز را محاسبه کرده و متناسب با آن پودر و آب مقطر را با هم مخلوط می کنیم) و حرارت می دهیم سپس برای نمونه هایی با حجم 1cc و کمتر، 5cc از این محیط کشت در لوله های آزمایش می ریزیم. اما اگر حجم نمونه از 1cc بیشتر باشد غلظت محیط کشت را دو برابر می کنیم(یعنی 70 گرم پودر در یک لیتر آب مقطر) و پس از حرارت دادن به میزان 10cc داخل لوله های آزمایش می ریزیم و در اتوکلاو 121˚c به مدت 15 دقیقه استریل می کنیم و پس از استریل شدن در یخچال نگهداری می کنیم و 24 ساعت قبل از انجام آزمایش تست استریل بودن را برای محیط کشت انجام می دهیم. برای انجام آزمایش حجم مورد نیاز نمونه را با حفظ شرایط استریل در مجاورت شعله در داخل لوله های آزمایش حاوی محیط کشت می ریزیم(روش انجام آزمایش 15 لوله ای است و معمولا سه رقت 10 و1 و0.1 و هرکدام 5 لوله مورد آزمایش قرار می گیرد). لوله های تلقیح شده را در انکوباتور 35˚c به مدت 24 ساعت قرار می دهیم بعد از این مدت اگر نشان رشد در لوله ها مشاهده شد آزمایش مثبت است در غیر این صورت لوله ها را برای 24 ساعت دیگر در انکوباتور قرار می دهیم پس از 24 ساعت دوم لوله هایی را که نشان رشد دارند مثبت و آنهایی که نشان رشد ندارند را منفی اعلام می کنیم. مرحله تاییدی: محیط کشت مورد استفاده برای این مرحله Pfizer Selective Entrococcus Agar یا PSE می باشد. این محیط کشت از مواد زیر تشکیل شده است: 1-peptone c 17gr 2- peptone B 3gr 3-yeast extract 5 gr 4-bacteriological bile 10gr 5-NaCl 5gr 6-sodium citrate 1gr 7-esculin 1gr 8-ferric ammonium citrate 0.5 gr 9-NaN3 0.25gr 10-agar 15gr 11-reagent-grade water 1lit pH محیط کشت پس از استرلیزاسیون 7.1±0.2 می باشد. برای ساخت این محیط کشت 58 گرم پودر PSE را در یک لیتر آب مقطر حل می کنیم( حجم محیط کشت مورد نیاز را محاسبه کرده و متناسب با آن پودر و آب مقطر را با هم مخلوط می کنیم). سپس محیط کشت را حرارت می دهیم تا مواد کاملا با هم مخلوط شوند بعد محیط کشت را در اتوکلاو 121˚C به مدت 15 دقیقه استریل می کنیم سپس با حفظ شرایط استریل و در مجاورت شعله مقدار لازم از محیط کشت اس

آزمونهاي بيولو‍ژيکي آب

مطالب مشابه :

منابع کارشناسی ارشد بهداشت محیط

محاسبات و طراحی تصفیه خانه فاضلاب (به روش لجن فعال)

منابع کارشناسی ارشد بهداشت محیط

تصفیه خانه پرکند آباد

منابع کنکورکارشناسی ارشد رشته مدیریت سلامت،ایمنی و محیط زیست 93-92

منابع آزمون کارشناسی ارشد مهندسي بهداشت محيط

آزمونهاي بيولو‍ژيکي آب

مدیریت مواد غذایی هنگام زلزله از دیدگاه بهداشت محیط