روش وسترن بلات يا ايمنو بلات

همان طوركه مي دانيم در تكنيك ELISA پروئين ها در سطح حفرات پليت پوشش داده مي شوند و در انتهاي آزمايش ELISA ،از يك واكنش رنگ زا براي شناسايي انجام واكنش يا عدم انجام آن استفاده مي شود.اما در وسترن بلات ابتدا پروتئين توسط الكترو فورز روي ژل اكريل اميد جدا شده ، سپس توسط جريان الكتريكي به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده مي شوند. اين غشا شبيه به كاغذ معمولي است ، ام اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانايي زيادي در اتصال به پروتئين دارد پس از اينكه پروتئين به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده شد بقيه مراحل شبيه به ELISA طي مي شود ف با اين تفاوت كه مسير حركت هر نمونه به شكل يك نوار بريده مي شود و درون ظزف خاصي كه شيار هايي به اندازه نوار بريده شده ، قرار مي گيرد و بقيه مراحل در اين ظرف انجام مي گيرد . به اين ترتيب به طور مثال اگر نمونه كشت ويروس HIV در اختيار داشته باشيم ، بايد ابتدا انرا الكترو فورز نماييم . پس از الكترو فورز باندهاي پروتئيني را به gp۴۱ و gp۱۲۰ هر يك بنا به اندازه مولكول آن ها ، روي ژل تفكيك مي شوند .اكنون باندهاي پروتئين را به غشاي نيترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدي به راحتي صورت گيرد .

پس از اينكه پروتئين ها به غشاي نيترو سلولوز منتقل شدند ، مرحله بعدي ميتواند به دو گونه طراحي شود :

الف) بعضي از مواقع هدف شناسايي پروتئين خاص در پروتئين هاي الكتروفورز شده است . اين حالت بيشتر در تحقيقات كاربرد دارد .

ب) در برخي موارد نيز مخلوط پروتيني ماهيت مشخصي دارد و حتي وزن مولكولي پروتئين هاي اين مخلوط و موقعيت آن ها پس از الكترو فورز مشخص مي باشند. در اين موارد مي توان حضور آنتي بادي عليه پروتئين هاي را در سرم مورد آزمايش بررسي نمود. در اكثر موارد تشخيص از يان روش استفاده مي شود . به طور مثال پروتئين هاي ويروس HIV الكترو فورز شده ،سپس به غشاي نيترو سلولوز منتقل مي شود . اكنون پس از مجاورت با سرم انساني هدف ازمايش بررسي وجود انتي بادي عليه پروتئين غشايي يا مركزي HIV است. در اين مواقع علاوه بر حضور يا عدم حضور آنتي بادي اختصاصي مي توانيم مشخص سازيم كه آنتي فرد عليه چه جزئي از عامل بيماري زا است .

به اين ترتيب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA در اينجا حذف مي شود و به طور اختصاصي واكنش دهي آنتي بادي ،مورد آزمون قرار مي گيرد . در بسياري مواقع كه چندين بار (۲ تا ۳ بار) تست ELISA يك عامل عفوني خطرناك براي يك بيمار مثبت مي گردد ، جهت تاييد تست الايزا از تست وسترن بلات استفاده مي شود نظير عفونت هاي HIV ، HTLV و HSV .

البته امروزه براي بسياري از عفونت هاي ويروسي و باكتريايي تست تاييد وسترن بلات موجود است . به لحاظ تكنيكي در مواردي كه هدف ارزيابي حضور آنتي بادي خاص در يك سرم باشد ، مراحل ذيل دنبال مي شود تا اينكه در انتها از طريق واكنش رنگ زايي رسوبي ، اتصال آنتي بادي به آنتي ژن مشخص گردد. از انجا كه جايگاه حركت و قرار گيري آنتي ژن روي نوار نيترو سلولز مشخص است ، مي توانيم مشاهده واكنش رنگي را دليل بر اتصال آنتي بادي اختصاصي به آن آنتي ژن بدانيم.

۱- الكترو فورز محلول پروتئين روي ژل پلي اكريل آميد در حضور سديم دو دسيل سولفات .

۲- اتقال باندهاي پروتئين جدا شده از ژل پلي آكريل آميد به كاغذ نيترو سلولز به وسيله جريان الكتريسيته .

۳- بريدنمسير حركت پروتئين ها روي كاغذ نيترو سلولز به شكل نوار .

۴- مجاور كردن اين نوارها با موادي نظير BSA۲% يا شير خشك بدون چربي تا اينكه ساير جايگاههاي كاغذ نيترو سلولز پوشش داده شود و پروتئين هاي مراحل بعدي آزمايش به آن متصل نگردد . در مواردي كه از كيت هاي تجاري استفاده مي شود ، معمولا نوار هاي بريده شده نيترو سلولز كه پروتئين ها به آن انتقال داده شده اند به همراه الگوي قرار گيري پروتئين ها در كيت وجود دارد. اين نوارها معمولا مراحل بلكينگ را نيز پشت سر گذاشته اند.

۵- در اين مرحله سرم مورد آزمايش با نوار نيترو سلولز مجاور مي شود . مدت زمان مجاور سازي مي تواند بين ۱ تا ۳ ساعت باشد.

۶- پس از چند بار شستشو نوار نيترو سلولوز (در همان شيار هاي مربوطه ) آنتي بادي ضد ايمونو گلبولين انساني كونژوگه شده با انزيم (در صورتي كه نمونه سرم مربوط به انسان باشد ) اضافه مي شود و پس از ۲-۱ ساعت (همراه با حركت دادن ظرف ) نوارها ۳تا ۵ بار توسط بافر مخصوص شستشو مي شوند.

۷- با ريختن سوبستراي انزيم بر روي نوار واكنش رنگي رسوبي در محل اتصال آنتي بادي ايجاد مي شود كه مي تواند نشانگر حضور آنتي بادي عبيه آنتي ژن خاص باشد . نوع سوبسترا به كار رفته وابسته به انزيمي است كه به انتهاي آنتي بادي ضد ايمونوگلوبين انساني متصل است . در مواردي كه اين آنزيم ‌Horse Radish Peroxdase باشد، سوبستراي بكار رفته مي تواند دي- آمينو بنزيدين و H۲O۲ باشد كه آنزيم با اكسيد كردن دي – آمينو بنزيدين ، رنگ قهوه اي تيره اي را در محل واكنش آنتي بادي – آنتي ژن رسوب ميدهد

بر گرفته از: كتاب روش هاي عملي در ايمنولوژي

روش وسترن بلات يا ايمنو بلات

مطالب مشابه :

وسترن بلات (Western blot)

وسترن بلات

بررسی روش وسترن بلات يا ايمنو بلات:

وسترن بلات

وسترن بلاتینگ(ایمونو بلات)