محیط کشت میکروب محیط

محیط کشت مک کانکی آگار ((Macconkey agar

محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتری های گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شوند. باکتری های تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبت ها) کلنی هایی به رنگ ارغوانی و باکتری هایی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفی ها) کلنی هایی بی رنگ ایجاد می نمایند.

رنگ ارغوانی کلنی های باکتری های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است.

معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.

حاوی مواد زیر است :
· پروتئین
· نمک صفراوی
· کلرید سدیم
· لاکتوز
· کریستال ویوله
· قرمز خنثی

محیط کشت متیل رد - وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth) MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم ها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.

آزمایشMR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت (PH=4/4)

ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف (PH=5/3)

ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف MR

1- متیل رد ۰۴/۰ گرم

۲- اتانول ۴۰ میلی لیتر

۳- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود ۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه:

مثبت: ظهور رنگ صورتی تا قرمز

منفی: تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A:

1- آلفانفتول: ۵ گرم

۲- الکل اتلیک مطلق: ۱۰۰ میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه (نی) شود. در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B:

1- هیدروکسید پتاسیم: ۴۰ گرم

۲- آب مقطر: ۱۰۰ میلی لیتر

محیط نوترینت براث (Nutrient broth ):

این محیط مبنای ساخت اکثر محیطهای کشت است و از عصاره گوشت تهیه می‌شود طرز تهیه آن مثل نوترینت آگار می‌باشد . این محیط بدلیل نداشتن آگار بصورت مایع در لوله آزمایش تهیه می شود .

محیط نوترینت آگار (Nutrient agar):

چنانچه ماده آگار را به نسبت ۵/۱ تا ۲ درصد با آبگوشت غذایی مخلوط کنیم، این آگار غذایی بدست می‌آید . این محیط مبنای تهیه انواع و اقسام محیط های کشت جامد مثل Blood Agar , Chocolate agar می باشد .

Nutrient Agar مرکب از پپتون، beef extract و آگار است. این فرمول نسبتاً ساده مواد مغذی لازم برای تکثیر تعداد زیادی از میکروارگانیسم هایی را که زیاد سخت رشد نیستند، فراهم می‌کند.

Beef extractمحتوی مواد محلول در آب شامل کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، ترکیبات نیتروژن آلی و نمک‌ها است. پپتون‌ها منابعی مهم از نیتروژن آلی، مخصوصاً اسیدهای آمینه و پپتیدهای بلند زنجیره هستند.

1: محیط کشت سیمون سیترات آگار ((Simmons Citrate agar

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن ومنبع انرزی ونمک آمونیوم رابه عنوان تنها منبع ازت جهت رشد خودبه کار برند قادراند محیط سیمون سیرات که حاوی معرف بروموتیمول آبی(سبزرنگ)است رابه رنگ آبی تبدیل کنند . در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.

روش کار :

باکتری را درمحیط سیمون سیرات که به صورت سطح شیبدار است کشت دهیدودردمای37درجه سانتیگراد به مدت 24ساعت نگهداری کنید درصورتیکه رنگ سبز اولیه به رنگ آبی تبدیل شود واکنش مثبت است(مثل کلبسیلا_ رنگ سبز نشانه منفی بودن واکنش است

2:یک محیط افتراقی است که دارای قند گلوکز لاکتوز پپتون وتیوسولفات سدیم می باشد. مقدار گلوکز یک دهم لاکتوز می باشد. از این محیط جهت بررسی تخمیرقندهای گلوکز، لاکتوز ،ایجاد گازSH2 می توان بررسی کرد. پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود . این محیط دارای دو قسمت استوانه ای وشیبدار است .

· ۱/۰% گلوکز ، ۱% لاکتوز ، ۱% سوکروز
· منبع سولفور
· کلرید سدیم
· پروتئین
· معرف SH2
· فنل رد

الف)مکانیسم شناسایی توانایی تخمیرقندهادرمحیط

دربسیاری ازباکتریها گلوکز اولین منبع انرژی مورد استفاده قرار می گیردو درصورت اتمام ازمنابع دیگراستفاده می کند

دراین محیط باکتری درصورت تخمیر قند ایجاد اسید می نماید که باعث تغییر رنگ معرف فنل ردازقرمز به زرد میدهد

دراین محیط درصورتیکه باکتری قادربه تخمیر قندها نباشدازپپتون استفاده کرده ورنگ معرف قرمز می شود لازم به ذکر است باکتریها فقط درشرایط هوازی قادربه تخمیر پپتون هستند

درصورتیکه باکتری قادربه تخمیر گلوکز باشد درسطح شیبدار واستوانه ایجاد اسید کرده ورنگ زرددر هردو قسمت ایجادمی شود پس ازچندساعت به دلیل اینکه درقسمت شیبدارباکتری بیشتری وجود دارد گلوکز تمام شده ودرصورتیکه بتواند از لاکتوز استفاده می کندرنگ محیط زردمانده که حالت اسید-اسیدگفته میشود.

درصورتیکه باکتری قادربه تخمیرقند گلوکز باشدولی نتواند لاکتوز راتخمیرکندهمانند حالت قبل پس از3ساعت اول قسمت سطح شیبدار واستوانه هردو زرد میشود ولی پس ازآن به علت تمام شدن گلوکز درسطح شیب دار باکتری ازپپتون استفاده کرده وقسمت شیبدار قرمز میشود ولی کماکان قسمت استوانه ای لوله به علت تعداد کمتر باکتری زردرنگ باقی می ماند (آلکالن-اسید) ذ

درصورتیکه باکتری قادربه تخمیر گلوکزولاکتوزنباشدازابتداازپپتون استفاده کرده قسمت شیبدارواستوانه قرمز میشود

(الکالن-الکالن)

ب) مکانیسم شناسایی توانایی احیای گوکردوتولید سولفید هیدروژن

دراین محیط باکتریهایی که قادر به تولید سولفیدهیدروژن هستند در ترکیب با آهن موجوددرمحیط کشت رسوب سیاهرنگ تولید می کنند مانندپروتئوس ها

ج)مکانیسم شناسایی توانایی تولید گاز

برخی ازباکتریها درجریان واکنشهای متابولیسمی گاز هیدروزن ومحتوی دی اکسید کربن تولید می کنند که موجب تشکیل حباب ویا پاره شدن محیط می شودوگاهی تجمع گاز درعمق محیط باعث راندن محیط کشت به بالای لوله می گردد

Results (slant/butt)	Symbol	Interpretation
Red/yellow	K/A	Glucose fermentation only, Peptone catabolized
Yellow/yellow	A/A	Glucose and lactose and/or sucrose fermentation
Red/red	K/K	No fermentation, Peptone catabolized
Red/no color change	K/NC	No fermentation, Peptone used aerobically
Yellow/yellow with bubbles	A/A,G	Glucose and lactose and/or sucrose fermentation, Gas produced
Red/yellow with bubbles	K/A,G	Glucose fermented only, Gas produced
Red/yellow with bubbles and black precipitate	K/A,G, H2S	Glucose fermentation only, Gas produced, H2S produced
Red/yellow with black precipitate	K/A, H2S	Glucose fermentation only, H2S produced
Yellow/yellow with black precipitate	A/A, H2S	Glucose and lactose and/or sucrose fermentation, H2S produced
No change/no change	NC/NC	No fermentation

A=acid production; K=alkaline reaction; G=gas production, H2S=sulfur reduction

روش کار

برای آزمایش کافی است که نوک آنس نوک تیز رابه باکتری آلوده نموده ومستقیم تا4میلیمتر به انتهای لوله به داخل محیط فروببرید وازهمان جهت خارج کرده وسپس درسطح شیبدار به صورت زیگزاگ کشت دهید.لوله های کشت داده شده رادر گرمخانه37درجه سانتیگرادبه مدت 16تا18ساعت نگهداری نمایید

3:Voges-Proskauer

محیط مایع و حاوی گلوگز است.حال اگر باکتری قادر باشد گلوگز را از راه Mixed acid تجزیه کند اسید حاصله با PH:4-4.5 با معرف متیل رد به رنگ قرمز در می آید.حال برخی از باکتریها دارای چرخه تخمیر بوتان دیول (BUtanediol fermentation) می باشند وازتخمیر گلوکز درمرحله نهایی ماده ای به نام استیل متیل کربینول (استوئین)PH:6-6.5تولید می کنند به معرف متیل رد جواب نمی دهد. این ماده درمحیط قلیایی ودرحضوراکسیژن به دی استیل تبدیل می شود .دی استیل ایجاد شده دراثر تاثیر کاتالیتیک آلفا نفتول وکراتین به ترکیب قرمز رنگ تبدیل شده که اساس تستvp راتشکیل می شود .

روش کار :

باکتری رادرمحیط MR-VPکشت داده پس از 4ساعت نگهداری دردمای 37درجه سانتیگراد 6دهم میلی لیتر(6قطره)آلفانفتول وسپس 2دهم میلی لیتر KOHباغلظت 40درصد رابه آن اضافه نماییدوبه خوبی مخلوط کرده وبرای مدت15دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید . ظهور رنگ قرمز درمحیط نشاندهنده حضور استوئین ومثبت بودن VPاست مثل (کلبسیلا)

4: اوره آز(Urea)

باکتریهای که دارای آنزیم اوره آزباشند بویژه انتروباکتریاسه. قادراند اوره موجود درمحیط را به دي اكسيد كربن، آب و آمونياك هيدروليز مي كنند. آمونياك در محلول به كربنات آمونيوم وآب تبديل شده و باعث قليايي شدن محيط و بالا رفتن pH مي شود.
Urea Agar توسط Christensen برای استفاده به عنوان محیط جامد برای تفکیک باسیل‌های روده‌ای درست شد. اوره آگار توسط Christensen با افزودن پپتون و دکستروز و کاستن مقدار بافر برای پیشروی سریع‌تر رشد بسیاری از انتروباکتریاسه و در نتیجه کاهش مدت زمان انکوباسیون درست شد.
وقتی ارگانیسم ها اوره را مصرف می‌کنند گاز آمونیاک درطی انکوباسیون تشکیل می‌شود که واکنش این محیط‌ها را قلیایی نموده و رنگ قرمز – صورتی تولید می‌نماید. تولید اوره آز با تغییر در معرف فنل رد نشان داده می‌شود.

طرز تهیه Urea Agar medium

5/1 گرم گرانوله را به 90ML آب خالص اضافه نمائید. آن گرم نموده و به مدت یک دقیقه بجوشانید. سپس محلول آگار را با اتوکلاو کردن در دمای 1210C به مدت 15 دقیقه استریل نمائید. آگار را تا دمای 50-45 درجه خنک نمائید و اجازه دهید لوله تهیه شده طبق دستور العمل اول به دمای اتاق برسد. سپس 10ML از این لوله را به 90ML محلول آگار خنک شده، اضافه نمائید و کاملاً مخلوط کنید. در صورت امکان هرچه سریعتر با رعایت شرایط آسپتیک در لوله‌های آزمایش استریل تقسیم نمایید. اجازه دهید لوله‌ها در وضعیت شیب‌دار خنک شوند به طوری که ته لوله‌ها به صورت عمق‌دار تشکیل شود.
15 gr urea Agar /9oo ml D.W 1.5 gr urea/ 90 ml D.W

روش کار :

باکتری رادرمحیط اوره که دارای معرف فنل رد می باشد به صورت مایع یاآگار کشت دهیدپس از18 تا24ساعت درصورتیکه باکتری قادربه شکستن اوره باشد باتولید آمونیاک باعث قلیایی شدن(محیط قرمز رنگ) محیط وموجب تغییر رنگ معرف فنل رد ازرنگ قرمز به رنگ ارغوانی پررنگ می شود . PHمحیط در اینصورت بیشتر از8/4 خواهد بود .(مثل:پروتئوس)

- سوش هاي اوره آز مثبت سريع : ايجاد رنگ قرمز در تمام محيط
- سوش هاي اوره آز مثبت ضعيف : ايجاد رنگ قرمز ابتدا فقط در سطح و بتدريج در عمق لوله

برنامه QC :
هر batch جديد از محيط كشت بايد با ارگانيسم هاي كنترل مثبت و منفي تست شود.
سوش كنترل مثبت: Proteus sp
سوش كنترل مثبت ضعيف: Klebsiella sp
سوش كنترل منفي : E. coli

توجه:
بايد به اهميت تفاوت محيط كشت اوره Broth و اوره آگار توجه شود. از آنجا که اوره Broth حاوي مقدار زيادي از بافر نمك هاي فسفات با 8/6 = pH مي باشد برای از بين بردن اثر بافر بايد مقدار نسبتا زيادی آمونياک توسط باکتری ايجاد شود تا pH محيط به بالاي 8 برسد و تغيير رنگ ايجاد شود.
محيط اوره آگار حاوي مقدار كمتري بافر نسبت به اوره Broth مي باشد و پپتون و گلوكز دارد. اين محيط غني بوده و رشد بسياري از باكتري هايي را كه نمي توانند در اوره براث رشد كنند، افزايش مي دهد. از طرفي کم بودن مقدار بافر در اوره آگار اجازه مي دهد كه مقدار كم آمونياك حاصل از هيدروليز اوره توسط باكتري هاي اوره آز ضعيف، مشخص شود. باكتري هايي كه اوره آز كمي ايجاد مي كنند مثل گونه هايي از كلبسيلا و آنتروباكتر و بروسلا در محيط اوره آگار، تست مي شوند.

:5محیط کشت لیزین آیرون آگار (Lysine iron agar)

محیط لیزین آیرون آگار دارای اسید آمینه لیزین گلوکز وپپتون است معرف این محیط بروموکروزول ارغوانی است ورنگ اولیه محیط بنفش می باشد . این محیط معمولا بصورت شیب داروقسمت استوانه ای می باشد .

از آنجاییکه که توانایی باکتری در دآمیناسیون در شرایط هوازی وتوانایی باکتری برای دکربوکسیلاسیون درشرایط بیهوازی بررسی می گردد قسمت بالای لوله برای واکنش لیزین دآمیناز وقسمت استوانه به منظور بررسی واکنش لیزین دکربوکسیلاز مطالعه می شود .

باکتری درابتدابامتابولیسم گلوکز باتولید اسید باعث تغییر رنگ محیط به زرد می شودوپس از آن درصورتیکه باکتری قادر به دکربوکسیلاسیون لیزین باشد درعمق لوله آزمایش باجدا کردن بنیان کربوکسیل از اسید آمینه باعث قلیایی شدن محیط وتغییر رنگ آن به بنفش می شود .لذا درصورتیکه رنگ قسمت استوانه ای پس از24ساعت بنفش باشدنشانه توانایی باکتری دردکربوکسیلاسیون لیزین است .

درصورتیکه باکتری قادر به دآمیناسیون لیزین باشد درسطح شیبدار لوله آزمایش باجداکردن بنیان آمین از اسید آمینه باعث اسیدی شدن محیط می گردد .این مورد به همراه استفاده باکتری از پپتون درشرایط هوازی و تولید ترکیبات قلیایی باعث تغییر رنگ سطح شیبدار محیط به قرمز آلبالویی می گردد .

لذادرصورتیکه رنگ قسمت شیبدار پس از 24ساعت قرمز آلبالویی باشد نشانه توانایی باکتری در دآمیناسیون لیزین است ودرصورتیکه باکتری قادر به دآمیناسیون لیزین نباشد سطح شیبدار به رنگ بنفش دیده می شود .

روش کار:

یک کلنی از باکتری موردآزمایش را به وسیله آنس نوک تیز به محیط کشت لیزین آیرون آگار منتقل کنید .برای این منظور ابتدا درقسمت استوانه ای رابافروبردن مستقیم آنس تاعمق محیط کشت نموده وسپس قسمت شیبدار رابهصورت زیگزاگ تلقیح نمایید .محیط کشت رابه مدت 24ساعت درگرمخانه37 درجه سانتیگراد نگهداری نمایید وسپس واکنشهای دکربوکسیلاسیون ودآمیناسیون رابررسی کنید دراین محیط همچنین تولید SH2رانیز می توان بررسی کرد

6: محیط کشت (Sulfide-Indol-Motility) SIM

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:

مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ای اندول توسط باکتری است. باکتری های که حاوی مجموعه آنزیم هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند، باشند، قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باکتری های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند. برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول:

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید: ۵ گرم

ایزو آمیل الکل: ۷۵ میلی لیتر

اسید کلریدریک: ۲۵ میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده و از بنماری ۵۵-۵۰ درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم. رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوه ای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

این محیط برای تفکیک باسیل‌های روده‌ای براساس تولید سولفید، تشکیل اندول حرکت به کار می‌رود. تولید سولفید هیدروژن، تشکیل اندول و حرکت، ویژگی‌هایی را تعیین می‌کنند که در شناسایی انتروباکتریاسه مخصوصاً سالمونلا و شیگلا کمک می‌کنند. این محیط را مراحل شناسایی پاتوژن‌های روده‌ای مفید است.
اجزاء SIM medium تعیین سه فعالیت باکتری‌های روده‌ای را که ممکن است متفاوت باشند امکان‌پذیر می‌سازند. یتوسولفات آمونیم فروز، معرف‌های تولید H2s هستند. سولفات آمونیم با گاز H2S واکنش می دهد تا رسوب سیاه سولفید فروز را تولید نماید. پپتون کازئین که سرشار از تریپتوفان است هنگامی که توسط بعضی از میکروارگانیسم ها مورد مصرف قرار می‌گیرد، در تولید اندول اثر می‌گذارد. اندول به دنبال دوره انکوباسیون با افزودن معرف‌های شیمیایی شناسایی می‌شود. شناسایی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد (Semi Solid ) محیط امکان پذیر است. رشد خارج از خط کشت مرکزی نشان می‌دهد که ارگانیسم تحت بررسی، متحرک است.
به دنبال انکوباسیون، از نظر وجود حرکت (انتشار رشد در خارج از خط کشت یا ایجاد کدورت در سراسر محیط) و برای تولید H2S (سیاه شدن در امتداد خط کشت) بررسی نمائید. برای بررسی و نشان دادن تولید اندول، 4-3 قطره معرف کواکسی را به لوله اضافه نمائید و رنگ قرمز (برای واکنش مثبت) را بررسی و مشاهده کنید.

محیط کشت میکروب محیط

مطالب مشابه :

مساحت ، محیط و حجم شکل های هندسی

مساحت ها ، محیط ها و حجم اشکال هندسی

حجم ومساحت اشکال هندسی /ریاضی ششم

مساحت ومحیط اشکال هندسی

محیط کشت میکروب محیط

فرمول مساحت و محیط اشکال هندسی