جداسازی DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز

تهیه ژل پلی آکریلامید :

قدرت تفکیک سازی این ژل بسیار بالا است و قطعات DNA با طول کم نیز در این ژل قابل رویت میباشند و بسته به در صد ژل حتی اختلاف یک باز را میتوان در قطعات DNA الکتروفورز شده مشاهده نمود .

1. شیشه ها، شانه ( Comb ) و فضاسازها ( Spacer) را با آب و دترژان خوب بشویید و سپس با الکل 70 در صد آنهارا تمیز کنید تا چربی دستها روی آنها باقی نماند ( بجای پنبه از گاز استفاده کنید زیرا پرزهای پنبه روی شیشه باقی میمانند )

2. قالب ژل را آماده کرده و جهت جلوگیری از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گیری (Seal) نمایید.

3. حجم قالب (cast ) را ( حجم ژل) با اندازه گیری طول وعرض قالب مشخص نمایید (قطر ژل بسته به قطر فضا سازها یک و یا نیم میلیمتر است)

4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آکریلامید و بیس آکریلامید لازم را (بصورت مخلوط 29 در صد آکریلامید و 1درصد بیس آکریلامید تهیه و در یحچال نگهداری میشود) داخل لوله تمیز بریزید.

5. از بافر 10xTBE با غلظت نهایی 1x اضافه کنید وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانید.

6. مقدار 100 میکرو لیتر آمونیوم پرسولفات 10درصد و 3 میکرو لیتر محلول TEMED به آن اضافه کنید ( توجه داشته باشید که مونومرهای اکریلامید وبیس آکریلامید در حال پلیمریزه شدن هستند).

7. به آرامی محلول را در قالب از قبل آماده شده بریزید و مراقب باشید که حباب هوا وارد آن نشود زیرا حباب هوا مانع انجام الکترو فورز میشود.

8. به آرامی شانه را داخل قالب قرار دهید تا بعد از پلیمریزه شده ژل ، درون آن چاهک هایی جهت نمونه گذاری ایجاد شود.

9. بعد از پلیمریزه شده به آرامی شانه را درآورده و چاهک هارا با آب بشویید تا اگر مونومرهای پلیمریزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند.

10. گیره پایینی را باز کنید وفضاساز پایینی را از قالب خارج کنید.

11. گیره های طرفین را باز کرده و دستگاه را طوری داخل تانک مخصوص قرار دهیدکه قسمت بریده شده شیشه رویی( Notch ) به سمت محفظه بالایی ( تانک فوقانی) قرار گیرد.

12. شیشه های دستگاه ( قالب) را با نصب گیره ها ی مخصوص به طرفین تانک, ثابت نمایید.

13. محفظه های بالا و پایین تانک را با 1xTBE buffer پرنمایید بطوریکه بافر روی چاهک ها را بپوشاند. چنانچه بین دوشیشه قالب ( محل خارج کردن فضاساز پایینی ) که در محفظه پایینی تانک قرار دارد حباب هوا مشاهده میشود با یک سرنگ پر از بافر که دار ای سر سوزن کج است حباب هوا را بیرون کنید تا مانع جریان الکتریکی نشود و الکترو فورز بخوبی انجام گیرد.

14. محصول PCR را ( همانند الکتروفورز با ژل آگارز) با بافر نمونه گذاری مخلوط کرده و توسط سرنگ هامیلتون نمونه گذاری را روی ژل انجام دهید.

15. محفظه بالایی تانک را به قطب منفی ومحفظه پایینی را به قطب مثبت منبع تغذیه وصل کرده و الکتروفورز کنید .

16. بعد ازخاتمه الکتروفورز ( وقتی رنگ نشانه به پایین ژل رسید) جریان برق را قطع کرده و شیشه را از تانک جدا کنید. با یک تیغه فلزی نازک به آرامی بین دو شیشه فشار آورید تا دو شیشه از هم جداشوند . ژل به یکی از دو شیشه می چسبد . به آرامی آنرا داخل آب حاوی 10 میکروگرم درهرمیلی لیتر اتیدیوم بروماید قرار دهید تا بعد از چند دقیقه ژل رنگ شود .

ژل را روی دستگاه UV Transilluminator قرار داده و نوارهای های DNA را مشاهده کنید.

جداسازی DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز

مطالب مشابه :

پروتكل (الكتروفورز DNA روي ژل آگارز) Electrophoresis

دانلود کلیپ زیبا در مورد تهیه ژل آگاروز و انجام الکتروفورز

دستگاه الکتروفورز

جداسازی DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز

الکتروفورز(محاسن و معایب)

درباره ی الکتروفورز

تجهیزات71- دستگاه الكتروفورز