همه چیز درباره RT-PCR معرفی روش Real Time PCR

همه چیز درباره RT-PCR

همه چیز درباره rt PCR

معرفی روش Real Time PCR

یکی از شاخه های علم بیولوژی مطالعه Transcriptomics سلول های مختلف تحت شرایط متفاوت و بررسی میزان و نوع بیان ژن های مختلف می باشد. از روش ها و مراحل مهم در پروژه های بیولوژی ملکولی استخراج یک ملکول RNA خاص و یا کل RNA از سلول های پروکاریوتی، یوکاریوتی و یا ویروس ها می باشد. معمولاً در مرحله بعد از این ملکول های RNA استفاده شده و با بهره گیری از آنزیم Reverse Transcriptase ملکول cDNA (کتابخانه cDNA) ساخته می شود. گروه پژوهشی پیشگامان انتقال ژن (GTP) با بهره گیری از کارشناسان ماهر و متخصصین به شما کمک می کند تا در کمترین زمان RNA مورد نظر خود و یا cDNA مطلوب خود را در اختیار داشته باشید

این تکنیک کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و تحقیقات دارد. در این روش میتوان یک سکانس خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونهای مورد مطالعه اندازه گیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل، غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود. سایر نامهای این تکنیک عبارتند از quantitative real time polymerase chain reaction و kinetic polymerase chain reaction. این تکنیک گاهی به اشتباه RT-PCR نامیده میشود که مخفف روش Reverse Transcription PCR است. ولی امروزه در دنیای تجارت و حتی مراکز تحقیقاتی بصورت یک اشتباه مصطلح در آمده است. گاهی روش Real-time PCR با رونویسی معکوس(reverse transcription) ادغام میگردد تا مقدار mRNA (messenger RNA) در سلولها و بافتها اندازه گیری شود. این تکنیک جدید، Real-time reverse-transcription PCR نامیده میشود و با علامتهای اختصاری qRT-PCR، RRT-PCRو یا RT-rt PCR مشخص میگردد.

در تکنیک Real-time PCR، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس استفاده میشود.

تعیین غلظت DNA با استفاده از رنگهای فلورسانس

در این تکنیک از رنگهایی استفاده میشود که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA (double-stranded:ds)، نور فلورسانس منتشر میکنند. بنابر این در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان فلورسانس در محلول افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آید. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNAی هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه میشود. لازم به ذکر است که رنگهایی نظیر SYBR Green به تمام انواع DNAی دو رشته ای، ازجمله محصولات غیر اختصاصی PCR و حتی دیمرهای پرایمر (Primer dimers) نیز متصل میشوند و این موضوع موجب کاهش اختصاصی بودن (Specificity) در نتایج حاصل میشود.

تعیین غلظت DNA با استفاده از شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس

در تکنیک Real-time PCR، دقیقترین و قابل اعتمادترین نتایج با استفاده از شاخص های گزارشگر فلورسانس بدست می آید که البته هزینه زیادی نیز در بردارد. در این روش از شاخصهای DNA یا RNA ی اختصاصی (sequence-specific RNA or DNA-based probe) استفاده میشود و در نتیجه در DNAی هدف، جستجو و تعیین غلظت برای سکانسهای خاص امکانپذیر میگردد. بنابر این حتی در حضور سایر انواع DNA، نتایج حاصل از نظر اختصاصی بودن، در حد بالائی است. در این شرایط، چنانچه از شاخصهای اختصاصی با رنگهای مختلف استفاده شود، حتی میتوان ژنهای متعددی را در یک واکنش PCR، مورد بررسی قرار داد.

کاربردهای Real-time PCR:

1. تعیین تعداد کپی از هر ژن: Wu, 2007; ABI TaqMan® Gene Copy Number Assays; Protocol for 7900HT

2. سنجش میزان بیان ژن:Giulietti, 2001 و Leung, 2005

3. بررسی صحت نتایج در آرایه ها: Rajeevan, 2001 و Verification of Array Results Page by Pfaffl

4. مطالعات ایمنی زیستی و پایداری ژنتیک: Lovatt, 2002

5. بررسی میزان اثر بخشی داروها و مانیتورینگ داروها: Leruez-Ville, 2004; Brennan, 2003; Burger, 2003; Kogure, 2004

6. انجام تکنیک Real-Time Immuno-PCR (IPCR): Adler, 2003; Barletta, 2004; Lind & Kubista, 2005

7. رسوب کروماتین با استفاده از اتصال آنتی ژن-آنتی بادی: Braveman, 2004; Sandoval, 2004; Wang, 2004; Iype, 2005; Potratz, 2005; Puppo, 2005

8. سنجش ویروسها: Niesters, 2001; Mengelle, 2003; Espy, 2006

9. شناسائی عوامل پاتوژن شامل:

شناسائی CMV: Kearns, 2001a; Kearns, 2001b; Kearns, 2002; Mengelle, 2003

تشخیص سریع آلودگی به مننگوکوک: Bryant, 2004

بررسی حساسیت استرپتوکوکوس پنومونیا به پنی سیلین : Kearns, 2002

شناسائی مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و گونه های مقاوم: Kraus, 2001; Torres, 2003; Cleary, 2003; Hazbon, 2004

پاتوژن های میکروبی در آبهای محیطی: Foulds, 2002; Guy, 2003

10. اندازه گیری میزان آسیب به DNA: Dietmaier, 2001

11. سنجش میزان تماس با اشعه رادیواکتیو: Blakely, 2001; Blakely, 2002; Grace, 2002; Grace, 2003

12. بررسی فرآیندهای زیستی در سلولهای زنده: Tung, 2000; Bremer, 2002

13. مطالعه DNAی میتوکندریائی: He, 2002; Liu, 2003; Alonso, 2004

14. شناسائی متیلاسیون: Trinh, 2001; Cottrell, 2004; Lehmann & Kreipe, 2004; Thomassin, 2004

15. تشخیص غیرفعال شدن ژنها در کروموزوم X: Hartshorn, 2002; van Dijk, 2002

16. تعیین همسانی در لوکوسهای HLA: Zhou, 2004

17. پیگیری نتایج پیوند عضو: Sabek, 2002; Gibbs, 2003

18. پیگیری نتایج، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز: Elmaagacli, 2002; Alizadeh, 2002; Thiede, 2004; Harries, 2004

19. پیگیری عوارض باقیمانده ناشی از بیماری، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز: Elmaagacli, 2002; Cilloni, 2002; Sarris, 2002; Gabert, 2003; Van der Velden, 2003

20. تعیین مقدار ژن و زیگوسیتی: (Bubner, 2004; Barrois, 2004; Chen, 2006; Szilagyi, 2006

21. ژنوتایپینگ و تشخیص انواع موتاسیونها شامل الحاق، حذف و موتاسیون نقطه ای: von Ahsen 2000; Donohoe, 2000; Lyon, 2001; Waterfall & Cobb, 2002; Bennett, 2003; Wittwer, 2003; Zhou, 2005; Palais, 2005; Chou, 2005، ; Mhlanga, 2001; Solinas, 2001; Song, 2002; Gupta, 2004; reviewed in Lareu, 2004، Kutyavin, 2000; Letertre, 2003; Johnson, 2004; Ugozzoli, 2004، Tapp, 2000

22. بررسی انواع تریزومی: Zimmermann, 2002

23. بررسی ژنوتیپهای حاصل از حذف جزئی یا microdeletion: Laurendeau, 1999; Kariyazono, 2001; Covault, 2003; Coupry, 2004

24. هاپلوتایپینگ: Von Ahsen, 2004; Pont-Kingdon & Lyon, 2005

25. بررسی کمی میکروساتلیت ها: Ginzinger, 2000

26. تشخیص قبل از تولد و تعیین جنسیت با استفاده از سلولهای جدا شده از خون مادرHahn, 2000; Bischoff, 2002; Bischoff, 2003 یا DNAی جنینی در جریان خون مادر Bischoff, 2002; Hwa, 2004

27. تشخیص قبل از تولد برای اختلالات هموگلوبین: Kanavakis, 1997; Vrettou, 2003; Vrettou, 2004

28. تشخیص سرطان در حین عمل جراحی : Raja, 2002

29 LATE-PCR که یک نوع real-time PCR جدید است و بررسی های کمی را در مقادیر جزئی از نمونه های بیولوژیک، امکانپذیر میسازد و بتریج کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی، دفاع بیولوژیک، پزشکی قانونی و تعیین سکانس DNA می یابد: Sanchez, 2004

کتابها

(Real-Time PCR (Dorak MT

(A-Z of Quantitative PCR (Bustin S

(Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications (Wittwer Hahn, Kaul

(Real-Time PCR: An Essential Guide (Edwards, Logan, Saunders

(Real-Time PCR: Current Technology and Applications (Logan, Edwards, Saunders

چکیده:

به طور کلی Real Time PCR تکنیکی برای مشاهده بی وقفه ی پیشرفت واکنش PCR در طول زمان می باشد. همچنین با این روش می توان مقادیر تولیدات PCR (DNA,cDNA یا RNA) را نیز اندازه گیری نمود.

این روش بر مبنای فلوروسنت تولیدی از مولکول گزارشگر (Reporter) می باشد که در طول واکنش افزایش می یابد. مولکول ها ی گزارشگر فلوروسنت یا به صورت رنگ هایی می باشند که به DNA دو رشته ای باند می شوند مانند SYBR® Green و یا بصورت شناساگرهای توالی های خاص مانند TaqMan® Probes می باشند. این تکنیک می تواند با حداقل اسید نوکلئیک آغاز شود و مقدار تولید نهایی را با دقت زیادی تعیین نماید. محدود به زمان و ذخیره منابع نمی باشد، به راحتی قابل اجرا است و دقت و حساسیت بالاتر از PCR معمولی دارد. این روش توانایی تشخیص بسط PCR را در مرحله اولیه واکنش دارد در حالی که تشخیص در PCR معمولی در مرحله نهایی واکنش می باشد.

کلمات کلیدی: Real Time PCR ، PCR معمولی، شناساگرهای مولکولی.

مقدمه

PCR مخفف Polymerase chain reaction می باشد که به معنی واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد. هدف از آن سنتز رشته های DNA جدید از روی رشته های الگو است که به صورت زنجیر وار تکرار می شود. PCR دارای انواع متعددی می باشد یکی از آنها Real Time PCR است که آن را ( Assay Homogeneos ) نیز می نامند به دلیل اینکه در آن برخلاف روش الکتروفورز اجزای واکنش دهنده PCR از یکدیگر جدا نمی شوند. دراین روش از ژل آگارز استفاده نمی شود و امروزه با دستگاه های به نام لایت سایکلر( Lightcycler) که مقدار محصول در هر سیکل را نمایش می دهد بسیار ساده شده است. در ساده ترین حالت از اتیدیوم بروماید ((EtBr به عنوان رنگ تداخلی با DNA برای تعیین مقدار محصو ل تولید شده در هرسیکل می توان استفاده کرد. ازانجایی که قابلیت فلورسانس اتیدیوم بروماید در حضور DNA دورشته ای افزایش می یابد, می توان از ان برای تشخیص وتعیین مقدارمحصول دورشته ای استفاده کرد. اتیدیوم بروماید تقریبا هیچ گونه اثری برروی مقدارو خصوصیات واکنش های PCR ندارد بنابراین تکثیر توالی های خاص DNA وتشخیص همزمان ان با دسگاه ترانس ایلومیناتور فرابنفش (UT Transilominator ( امکان پذیر می گردد. در این مقاله هدف, معرفی روش Real Time PCR وکاربردهای ان ومقایسه آن معمولی PCR می باشد.

مراحل ازمایشگاهی PCR

1-واسرشت سازی دو رشته DNA : دراین مرحله DNA دو رشته ای در درجه حرارت بالا(حدود ۹۵ درجه) به منظور به دست اوردن مولکول های DNA تک رشته ای, واسرشت می شود.

۲-هیبریداسیون: در این مرحله توسط پرایمر های الیگونوکلئوتیدی که مکمل توالی DNA تک رشته ای شده هدف می باشند در درجه حرارت حدود ۴۰تا ۶۵ درجه هیبریداسیون صورت می گیرد

۳-طویل سازی(بسط یا سنتز): در این مرحله با یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پلیمراز در درجه حرارت حدود ۷۲ درجه سانتی گراد طویل سازی رشته صورت می پذیرد.

این مراحل پی درپی تکرار می شوند به طوری که تعداد قطعات DNA در هر سیکل دو برابر می شوند.به قطعاتی که در هر سیکل به صورت تصاعدی افزایش می یابند آمپلیکون(Amplicon) می گویند.

مراحل نموداری PCR

در هر نمودار PCR سه مرحله قابل تشخیص است:

۱- مرحله نمایی (صعودی): در هر سیکل در این مرحله محصولات مضاعف می شوند.

۲- مرحله خطی: در این مرحله اجزای واکنش در حال مصرف شدن می باشند و واکنش به کندی پیش می رود و طول تولیدات در حال کاهش می باشند.

۳- مرحله پلاتئو: واکنش متوقف شده است بیشتر محصولات ساخته نشده اند و تولیدات PCR رو به تنزل می باشند.

روش کار Real Time PCR

در این روش از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCR به کار می رود. فلوروسنت از مولکول گزارشگر ساتع می شود که تولیدات را چند برابر می کند. بر مبنای ملکولی که برای تشخیص استفاده می شود این تکنیک به دو روش تقسیم بندی می شود:

۱-تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ های باند شده بهDNA

در اینجا از رنگ های باند شده به DNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش PCRاستفاده می شود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساتع شده در سیکل، می توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. اگر نموداری میان لگاریتم مقدار شروع واکنش و افزایش فلوروسنت گزارشگر ترسیم شود یک رابطه خطی مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBR® Green به همراه DNA دو رشته ای به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده می شود. این رنگ به شکاف کوچک از مارپیچ دو رشته ای DNA باند می شود. در داخل محلول, رنگ هایی که باند نشده اند فلوروسنت خیلی کمی را نشان می دهند و فلوروسنت زمانی به وضوح افزایش می بابد که رنگ به DNA دو رشته ای پیوسته شود. SYBR® Green تحت شرایط PCR پایدار وبا ثبات باقی می ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. همان طور که پیشتر ذکر شد از اتیدیوم بروماید نیز برای تشخیص می توان استفاده کرد ولی به علت سرطان زا بودن ان کمتر استفاده می شود.

۲-تشخیص اختصاصی با استفاده از شناساگرهای هدف

در این روش از تعدادی شناساگرهای الیگونوکلئوتیدی استفاده میشود که از رنگ فلوروسنت گزارشگر به همراه رنگ خاموش کننده) (Quencher استفاده می شود. شناساگرهای مورد استفاده در اینجا شامل Molecular Beacons , TaqMan® Probes , FRET Hybridization Probes و Scorpion® Primers می با شد.

فعالیت ’۵ نوکلئاز در تشخیص Real time به کار می رود. برای سنجش ’۵ نوکلئاز یک الیگو نوکلئوتید کهTaqMan® Probes نامیده می شود به ترکیب واکنش گر PCR اضافه می شود. شناساگر به منظور گرم کردن توالی خاصی از الگو بین رشته پیشرو و رشته معکوس در حال ساخت طراحی می شود. شناساگر در مسیری از آنزیم که از آنجا نسخه برداری DNA و یا cDNA شروع می شود قرار داده می شود. زمانی که انزیم به شناساگر گرم شده می رسد فعالیت ’۵ نوکلئازی انزیم، موجب شکافته شدن شناساگر می شود. توالی TaqMan® Probes در انتهای ’۵ خود رنگدانه ای با انرژی بالا دارد که Reporter (گزارشگر) نامیده می شود ودر انتهای ’۳ خود یک مولکول با انرژی پایین به نام )Quencherخاموش کننده( دارد. شکل زیر نشان می دهد زمانی که این شناساگر دست نخورده است وبه وسیله منبع نور القاء می شود، رنگدانه Q مانع نشر رنگدانه R می شود در نتیجه این عمل رنگدانه ها به هم نزدیک می شوند. هنگامی که شناساگر بوسیله فعالیت ’۵ نوکلئازی آنزیم شکافته می شود فاصله بین R و Q افزایش می یابد و این موجب توقف انتقال انرژی می شود. القای فلوروسنت ی R افزایش می یابد در حالی که Q کاهش پیدا می کند.

افزایش سیگنال R بوسیله ابزار تشخیص توالی گرفته می شود و سپس بوسیله نرم افزار نمایش داده می شود. شکل زیر افزایش سیگنال R را بر حسب زمان نشان می دهد. میزان افزایش سیگنال R متناسب با مقدار تولید برای یک نمونه معین می باشد.

: Fluorescent Resonance Energy Transfer - FRE

FRET در سنجش ’۵ نوکلئاز استفاده می شود به این صورت هنگامی که رنگدانه محتوی انرژی بالا به رنگدانه محتوی انرژی پایین نزدیک شود، انرژی از بالا به پایین القا می شود. FRETابزاری برای جمع آوری داده در این تکنیک می باشد.هنگامی که سیگنال R به سطح قابل تشخیص افزایش می یابد می توان ان را مهار کرد و بصورت نمودار نشان داد.نمودار توسعه شامل اطلاعات لازم برای اندازه گیری کمی DNA وRNA می باشد. سطح آستانه (Threshold line ) سطحی از واکنش است که شدت فلوروسنت در بالاتر از ان قابل تشخیص است. دوره ای که نمونه به این سطح می رسد دوره استانه ( Cycle threshold) می نامند. سطح استانه و دوره استانه در انالیز دادهای مورد استفاده در سنجش ’۵ نوکلئاز اهمیت ویژه ای دارند.

مقایسه Real Time PCR با PCR معمولی: Real Time PCR توانایی تشخیص در مراحل اولیه واکنش یعنی مرحله نمایی را دارد در حالی که در روش PCR معمولی از ژل الکتروفورز در مراحل پایانی یعنی مر حله پلاتئو واکنش استفاده می شود.

محدودیت های نقطه پایانی PCR

به محض پیشرفت PCR، واکنشگرها تکثیر شده و مصرف می شوند. این کاهش در هر مرحله به نسبت مختلفی رخ خواهد داد. بنابراین نمونه ها از نظر مقداری بایکدیگر اختلاف پیدا خواهند کرد. این کاهش در مرحله خطی واکنش می باشد به همین دلیل حالت پلاتئو برای هر نمونه متفاوت خواهد بود. در حقیقت اگر اندازه گیری ها در مرحله پلاتئو انجام شود داده ها به درستی نمایان گر مقادیر اولیه در شروع واکنش نمی باشند. تشخیص بر اساس نقطه پایانی دقت و حساسیت پایین و قدرت تفکیک پذیری کم دارد.. نتایج این تشخیص در تعداد زیاد صدق نمی کند و به صورت خودکار نیز قابل اجرا نیست. تفکیک پذیری منحصرا بر اساس اندازه نیز از محدودیت های نقطه ی پایانی برای تشخیص میباشد.

کاربردهای Real Time PCR

1- تحقیقات میزان بیان mRNA . ۲- اندازه گیری میزان همانند سازی DNA در ژنوم یا DNAهای ویروسی. ۳- میزان تأثیر دارو درمانی. ۴- سنجش آسیب های .DNA ۵- تشخیص عوامل بیماری زا. ۶- تعیین ژنوتیپ افراد. ۷-سنجش تفکیک شدن آللی.

نتیجه گیری:

نتایجReal time PCR سریع و دقیق بدست می اید در این روش از مرحله نمایی واکنش برای تشخیص استفاده می شود که مزیت هایی را نسبت به مرحله پلاتئو که در روش معمولی استفاده می شود دارد . محدوده دینامیکی تشخیص افزایش می یابد و نیز نیازی به سرعت و عجله در انجام پروسه PCR نمی باشد. این تکنیک قدرت تفکیک پذیری بالای دارد به طوری که قادر به تشخیص تغییرات کمتر از دو فولد نیز می باشد. در حالی تفکیک پذیری ژل آگارز بسیار ضعیف می باشد. این روش برای ارزیابی مقادیر دقیقی از DNA و RNA استفاده می شود در ضمن دشواری های روش معمولی را ندارد.

مجید پسندیده ۱، محمد رضا محمدآبادی ۲

۱-دانشجوی دوره کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح نژاد دانشگاه شهید باهنر کرمان

۲- عضو هیئت علمی دانشگاه شهید باهنر کرمان

http://microbiology1.blogfa.com

میکروبیولوژی مسجدسلیمان

Reference

1- Bachmann, M.H., Mathiason-Dubard, C., Learn, G.H., Rodrigo, A.G., Sodora, D.L., Mazzetti, P., Hoover, E.A., and Mullins, J.I. 200. Genetic diversity of feline immunodeficiency virus: dual infection, recombination, and distinct evolutionary rates among envelope sequence clades. J irol 71, 4241-53.

2-. Belgrader, P., Okuzumi, M., Pourahmadi, F., Borkholder, D.A., and Northrup, M.A. 2001. A microfluidic cartridge to prepare spores for PCR analysis. Biosens Bioelectron 14,

849-52.

3- Chiang, P.W., Song, W.J., Wu, K.Y., Korenberg, J.R., Fogel, E.J., Van Keuren, M.L.,Lashkari, D., and Kurnit, D.M. 1996. Use of a fluorescent-PCR reaction to detect genomic sequence copy number and transcriptional abundance. Genome Res 6, 1013-26.

4- Belgrader, P., Benett, W., Hadley, D., Long, G., Mariella, R., Jr., Milanovich, F., Nasarabadi, S., Nelson, W., Richards, J., and Stratton, P. 1998a. Rapid pathogen detection using a microchip PCR array instrument. Clin Chem 44, 2191-