مارکرهای مولکولی

‌‌‌‌در سال‌ 1990 دو گروه‌ تحقيقاتي‌ همزمان‌ روشي‌ را براي‌ سنجش‌ ميزان‌ چند شكلي ابداع‌ كردند. يك‌ گروه‌ در شركت‌ دوپونت كه‌ روش‌ خود را RAPD ناميدند و گروه‌ ديگر در مؤِسسه ‌تحقيقات‌ زيست‌ شناسي‌ كاليفرنيا كه‌ روش‌ خود را واكنش‌ زنجيره ای پلي‌ مراز با پرايمر تصادفي ‌Arbitrarily Primed PCR ناميدند.‌‌‌‌ در اين‌ روش‌ يك‌ آغازگر چند نوكلئوتيدي‌ كوتاه‌ كه‌ به طور تصادفي‌ از توالي هاي‌ بازي A‌ انتخاب‌ شده‌ است‌؛ در مجاور ساير مواد لازم‌ براي‌ تكثير درPCR قرار مي‌گيرد. در اين‌ تكنيك‌ چند شكلي‌هاي DNA ‌ يا از اختلافات‌ موجود در توالي DNA ‌در مكان هاي‌ اتصال‌ آغازگر، يا از طريق ‌دگرگوني هایي‌ كه‌ در اثر اضافه‌ شدن‌ و حذف‌ و انورسيون‌ در نواحي‌ تكثير شده‌ روي‌ داده‌ است؛ ‌مشاهده‌ مي‌گردد.‌‌‌‌‌‌ اگر مكان هاي‌ اتصال‌ آغازگر روي‌ دو رشته‌ الگو، در فاصله مناسبي‌ قرار گرفته‌ باشند؛ DNA پليمراز قادر به‌ طي‌ كردن‌ فاصله‌ دو پرايمر اتصالي‌ خواهد بود. در اين‌ روش‌ به طور كلي‌ از آغازگرهایي‌ با طول‌ 10-9 نوكلئوتيد با حداقل‌ محتواي‌ %50 GC استفاده‌ مي‌شود.<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

این روش سریع بوده، به مقدار کمی DNA نیاز داشته و به رادیواکتیویته نیاز ندارد. ‌‌‌‌ماركر RAPD يك‌ ماركر غالب‌ است‌ زیرا چند شکلی ها متکی به حضور یا عدم حضور نوارها بر روی ژل های رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید مشخص می گردد و در آن‌ ژنوتيپ‌ افراد هتروزيگوت‌ را نمي‌توان‌ تشخيص داد. اين‌ مسئله‌ باعث‌ كم‌ ارزش‌ شدن‌ آن‌ در F2 شده‌ است‌. همانند آیزوزایم ها و مارکرهای RFLP، از RAPD برای تهیه نقشه ژنتیکی، برآورد رابطه ژنتیکی و ردیابی صفاتی مثل مقاومت به بیماری به کار می رود. ‌‌‌‌كاربرد RAPD درگونه‌هاي‌ پستاندار محدود است‌ و كمتر در مطالعات‌ حيواني‌ استفاده‌ مي‌شود. علاوه ‌بر غالبيت، دماي‌ اتصال‌ پايين‌ به‌ علت‌ كوتاهي‌ پرايمرها، احتمال‌ وقوع‌ اتصالات‌ اشتباهي‌ را بالا مي‌برد.

به طور کلی مارکرها انواع مختلفی دارند. در یک تقسیم بندی کلی می توان مارکرها را به صورت مارکرهای فنوتیپی و مارکرهای مولکولی دسته بندی کرد.

مارکرهای فنوتیپی همان گونه که از نام آنها مشخص است از روی فنوتیپ ارزیابی می شوند و لذا ارزیابی آنها خیلی ساده است. تعداد این مارکرها کم است و پلی مورفیزم کمی نیز تولید می کنند. از طرفی در اغلب موارد مارکر فنوتیپی در واقع یک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگی بوته، ابلق بودن برگ ها و ... لذا امروزه از این نوع مارکرها استفاده نمی شود.

مارکرهای مولکولی خود به دو دسته مارکرهای بیوشیمیایی و مارکرهای DNA تقسیم می شوند.

مارکرهای بیوشیمیایی شامل موارد متعددی است. این نوع مارکرها نیز امروزه کارایی زیادی ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پلی مورفیزم کافی ایجاد نمی کنند، لیکن نکته مثبت در آنها هم بارز بودن است.

این گروه را می توان به دسته های زیر تقسیم کرد:

الف. مولکول های بیوشیمیایی کوچک: مثل ترکیبات فنولی، ترکیبات معطر و ...

ب. پروتئین های ذخیره ای: مثل گلوتنین و گلیادین که در گندم خصوصاً در تعیین ارزش نانوایی کاربرد دارد.

ج. آیزوزایم ها: اینها در واقع فرم های مختلف یک آنزیم هستند که یک واکنش را کاتالیز می کنند ولی ممکن است سرعت فعالیت آنها متفاوت باشد. این مارکرها در دهه 80 کاربرد زیادی داشتند. تنکسلی توانست بر اساس آیزوزایم ها در گوجه فرنگی اولین نقشه لینکاژی را طراحی نماید.

مارکرهای DNA در واقع مهم ترین و کاربردی ترین سیستم های مارکری هستند که گستردگی زیادی داشته و هر روزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولین سطح بیان ژن مطرح می شوند؛ خیلی دقیق بوده، دارای تنوع زیاد و پلی مورفیزم بالا هستند.

براون (1999)، مارکرهای DNA را به ساختمان ها و اماکن مهم در یک شهر تشبیه می کرد که می توان نقاط شهر را نسبت به آنها آدرس داد و مکان یابی نمود.

مارکرهای DNA انواع بسیار زیادی دارند. تقسیم بندی رایج به صورت زیر است:

1- مارکرهای مبتنی بر هیبریداسیون

2- مارکرهای مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)

بازرترین نوع مارکرهای نوع اول، RFLP می باشد. VNTR ها و میکروساتلیت ها نیز در این گروه قرار دارند. در این نوع مارکرها یک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هیبریداسیون استفاده می شود. RFLP در سال 1980 توسط Botstain ابداع شد و دقت بسیار زیادی دارد. لیکن امروزه به دلیل وقت گیر و پر زحمت بودن آن، کمتر استفاده می شود. RFLP ها به عنوان قطعات متفاوت از DNA هضم شده با اندونوکلئاز انحصاری که با استفاده از کاوشگر (پروب) شناخته شده بین افراد معلوم می گردد. قطعات مختلف DNA توسط آنزیم های برشی ویژه ای که توالی های خاصی از نوکلئوتیدهای DNA را تشخیص داده و برش می دهند، تولید می گردد. یک گونه گیاهی تیپیک ممکن است در هر سلول تقریبا یک بیلیون جفت و یا بیشتر باز داشته باشد. پس از این که آنزیم برشی،DNA را برش داد؛ قطعات زیادی به وجود خواهد آمد که دامنه طولی از چند صد جفت باز تا بالغ بر چند هزار جفت باز دارند. همه این تعداد زیاد قطعات آنالیز نخواهند شد، بلکه توالی های خاص از DNA که در طول ژنوم توزیع شده و نسبت به DNA ی کلون شده مکمل هستند؛ برای حصول الگوی برشی در گیاهی خاص مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت.

مارکرهای مبتنی بر PCR آنهایی هستند که برای آشکار سازی از پرایمر (1 یا 2 پرایمر) استفاده می شوند. این گروه شامل طیف وسیعی از مارکرها می باشد و از آنجا که خیلی سریع قابل انجام هستند؛ هر روزه گسترش بیشتری می یابند. RAPD، DAF، AFLP، SSR، STS، SCAR، ALP و ... نمونه هایی از این مارکرها هستند.

RAPD: یکی از مهمترین این مارکرهاست. نیازی به داشتن توالی خاصی از DNA ندارد و پرایمرهای آن کاملاً تصادفی طراحی می شوند. غالب بودن و عدم تکرار پذیری و همچنین عدم تشخیص سیستم آللی از معایب بزرگ آن می باشد.

AFLP: یکی از کارآمدترین سیستم های مارکری است که توسط Vos و همکاران (1995)، ابداع شد و در آن سعی شده است که دقت RFLP و سرعت PCR با هم در یک سیستم جمع شود. مهم ترین مشکل آن غالب بودن است.

برای بررسی تنوع ژنتیکی از AFLP استفاده می شود. این مارکر تمامی ویژگی های یک مارکر های مولکولی مناسب را غیر از همبارز بودن دارد. مارکرهای AFLP مارکرهای غالب هستند. با این حال به علت پلی مورفیسم بالایی که مارکرهای AFLP تشخیص می دهند؛ کارآمدترین مارکر هستند. به خصوص در جایی که روابط نزدیکی وجود دارد و از نگاه تکنیکی هیچ اطلاعاتی از توالی DNA نیاز نیست؛ مارکرهای زیادی را می توان در مدت کوتاهی بررسی نموده و تنها مقدار کمی DNA لازم است.

SSR: شامل طیف وسیعی از مارکرهاست که همگی بر اساس توالی های تکراری ژنوم استوار هستند.میکروساتلیت ها توالی های 7-1 نوکلئوتیدی حد اکثر تا 100 بار پشت سر هم تکرار شده اند. تکرارها می تواند AG، AC، GC و ... باشد. میکروستلیت ها در ژنوم پستانداران خیلی زیادتر هستند. این گروه مارکرها پلی مورفیزم بسیار زیادی دارند و از طرفی هم بازر نیز هستند. ویژگی دیگر آنها این است که چنانچه پیوستگی ژنی با یک مارکر میکروستلیت تأیید شود؛ در واقع آن ژن، نقشه یابی نیز شده است.

STMS، STR، RAMP، RAMPO، MP-PCR، SAMPLE و ... مارکرهایی هستند که بر اساس میکروساتلیت ها طراحی شده اند. این مارکرها خیلی شبیه به هم هستند و فقط در موارد کوچکی اختلاف دارند. سعی شده است که خصوصیات مفید مارکرهای دیگر را با میکروساتلیت ها تلفیق کنند تا کارآیی سیستم مارکری افزایش یابد. مثلا مارکر RAMP تلفیقی از SSR و RAPD است. SAMPLE که شاید قوی ترین مارکر در این گروه باشد تلفیقی از SSR و AFLP می باشد.

کارآیی این گروه مارکری توسط Gupta در سال 2000 در مورد گندم به طور مفصل بررسی شده است.

کاربرد مارکرهای DNA

1- توالی یابی ژنوم: شاید مهم ترین کاربرد مارکرها باشد. از آنجا که ژنوم یوکاریوت ها خیلی بزرگ است؛ برای توالی یابی آن باید ژنوم را به قطعات خیلی کوچک تقسیم کرد و هر قطعه را جداگانه توالی یابی نمود. لذا باید روی DNA نقاط معیاری وجود داشته باشد تا بتوان بر اساس آنها نتایج حاصل از توالی یابی قطعات را کنار هم چید. این معیارها می توانند همان مارکرها باشند (Brown,1999).

2- Gene tagging: عبارتست از یافتن پیوستگی بین صفت مورد نظر با یک مارکر. این امر با بررسی تقرق هم زمان (Cosegregation) صفت و مارکر تحقق می یابد.

3- Gene mapping: عبارتست از تعیین محل یک ژن روی کروموزوم.

4- بررسی روابط خویشاوندی: با استفاده از پلی مورفیزم مارکری می توان افراد مختلف را از هم متمایز ساخت. این مورد بیشتر در مطالعات فیلوژنتیکی و تعیین مبدأ تنوع اهمیت دارد.

5- تعیین گروه های هتروتیک: در تهیه بذر هیبرید، تعیین لاین های اینبرد والدینی اهمیت زیادی دارد. این والدین باید طوری انتخاب شوند که تعداد هتروزیس حداکثر باشد. مقدار هتروزیس به میزان غالبیت در هر لوکوس و فاصله ژنتیکی والدین بستگی دارد. این فاصله ژنتیکی را می توان از آنالیز کلاستری که با استفاده از پلی مورفیزم مارکری در بین اینبرد لاین های مختلف به دست می آید تعیین کرد و بهترین اینبردها را انتخاب نمود.

6- انتخاب به کمک مارکر (MAS)

مهم ترین کاربرد مارکرها در اصلاح نباتات است. هدف این است که بتوان صفت مورد نظر را با واسطه مارکر پیوسته با صفت، انتخاب کرد. این مسأله بسیار مهم است چرا که اگر پیوستگی یک مارکر با ژن مورد نظر تأیید شود؛ آنگاه می توان در هر مرحله ای از رشد گیاه و در هر محیطی اقدام به گزینش نمود.

اغلب صفات مهم زراعی مثل عملکرد، مقابله با خشکی و شوری و ... صفاتی کمی هستند که توسط لکوس های کمی (QTL) کنترل می شوند. لذا امروزه در پروژه های اصلاحی سعی بر نقشه یابی QTLها است تا بتوان از آنها در MAS استفاده کرد.

7- حفظ ذخایر ژنتیکی: به کمک مارکرها می توان تنوع ژنتیکی موجود را بررسی کرد و در حفظ و سازماندهی آن اقدام نمود.

منابع

1. Brown T.A, 1999 . Genome. BIOS. publisher

2. Gupta P.K, R.K. Varshney. 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113: 116-185.

مطلب فوق برگرفته از وبلاگ زیر است.

http://plantbiotechno.blogfa.com

مارکرهای مولکولی

مطالب مشابه :

انواع مارکرها