ايمني سنجي به چند روش- روش‌هاي مختلف سنجش ايمني و بررسي مزايا و معايب آنها
ماهنامه تخصصي مهندسي پزشکي- شماره 67 ، سال 6 ، آبان/1385 
(149 کیلو بایت 
)
پست الکترونیکی: -
ايمني سنجي به چند روش
دكتر مجتبي صلوتي، گروه ميكروبيولوژي، دانشگاه آزاد زنجان
مهندس فرانك سقطچي، گروه راديولوژي، دانشگاه علوم پزشكي زنجان
دكتر احمد بيطرفان رجبي، بخش پزشكي هسته‌اي بيمارستان قلب شهيد رجايي
روش‌هاي مختلف سنجش ايمني و بررسي مزايا و معايب آنها
مقوله روش‌هاي مختلف سنجش مواد يكي از مهم‌ترين شاخه‌هاي تحقيقاتي به‌شمار مي‌آيد كه گاه نقاط عطفي در اين ميان پديد مي‌آمده و روش جديدي مطرح مي‌گردد و تا رسيدن به روشي تازه، تحقيقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبلي ادامه مي‌يابد. بديهي است كه هر روش معايب و محاسن خود را داشته و با توجه به اين ويژگي‌ها گسترش يافته يا محدود ميشود. گاهي نيز روش‌هاي جديد جايگزين روش‌هاي قبلي نيست، بلكه به موازات آنها از محدوديت‌هاي موجود مي‌كاهند.
امروزه انواع روش‌هاي دستگاهي جهت سنجش‌هاي ويژه و حساس آناليت‌ها طراحي و در دسترس محققان قرار گرفته است.
با پيشرفت جوانب مولكولي علوم مختلف، نيازي به اندازه‌گيري روزانه بسياري از آناليت‌ها احساس مي‌شد، اما روش‌هاي دستگاهي مذكور براي اين امر محدوديت‌هايي داشتند. از جمله اين محدوديت‌ها مي‌توان به
هزينه بالاي خريد دستگاه مذكور، هزينه بالاي مواد مصرفي و نگهداري دستگاه، نياز به تخصص كافي كاربر، زمان طولاني سنجش و محدوديت تعداد اندازه‌گيري روزانه اشاره كرد.
در ابتداي نيمه دوم قرن بيستم، محصول سيستم ايمني هومورال يعني آنتي‌بادي‌ها يكي از نقاط عطف مورد بحث را به وجود آورد. آنتي‌بادي‌ها با اتصال ويژه به آناليتي كه بر ضد آن تهيه شده است به عنوان ابزاري مناسب براي سنجش‌هاي ويژه و سريع در اختيار محققان قرار گرفت. روش‌هايي كه از آنتي‌بادي‌ها به عنوان فاكتور شناساگر بهره مي‌گيرد، روش‌هاي سنجش ايمني نام دارد. ابداع اين روش به سال 1959 برمي‌گردد.
«Yalow» و «Berson» محققاني بودند كه با استفاده از آنتي‌ژن نشاندار (راديواكتيو) و آنتي‌بادي ويژه، هورمون انسولين را براي اولين بار مورد اندازه‌گيري قرار دادند. آنها كه در سنجش خود از محصول سيستم ايمني و راديواكتيويته استفاده كرده بودند، روش مذكور را سنجش ايمني راديواكتيو نام نهادند.
اساس روش‌هاي سنجش ايمني
شناسايي آناليت، اولين مرحله در اين نوع سنجش محسوب ميشود. اين عمل توسط آنتي‌بادي انجام مي‌پذيرد. به عبارتي، جزء لاينفك هر سنجش ايمني واكنش ميان آنتي‌ژن و آنتي‌بادي است.
در برخي موارد در محدوده معيني از غلظت آنتي‌ژن و آنتي‌بادي انجام واكنش منجر به تشكيل رسوب قابل رؤيت (قبل يا بعد از رنگ‌آميزي) مي‌گردد. اما در اغلب موارد، قبل و بعد از انجام واكنش آنتي‌ژن و آنتي‌بادي تغيير قابل مشاهده‌اي وجود ندارد، به همين دليل وجود سيستم نشانه‌گذاري ضروري به نظر مي‌رسيد. همان‌طور كه اشاره شد در اولين سنجش كمي ايمني، محققان از مواد راديواكتيو براي نشاندار سازي استفاده نمودند.
جالب است بدانيد يك نوع طبقه‌بندي سنجش‌هاي ايمني بر اساس نام نوع نشاندارسازي سنجش بنا شده است. به عنوان نمونه، سنجش‌هاي ايمني راديواكتيو، سنجش‌هاي ايمني آنزيمي، سنجش‌هاي ايمني فلوئورسانس و ... به دليل قدمت سنجش‌هاي ايمني راديواكتيو ابتدا به شرح مختصر اين روش، خصوصيات و معايب آن خواهيم پرداخت.
سنجش‌هاي ايمني راديواكتيو
در واكنش ميان آنتي‌ژن و آنتي‌بادي هر كدام از اين دو جزء را مي‌توان با ماده راديواكتيو نشاندار ساختو از لحاظ رديابي كمپلكس ايجاد شده، تفاوتي ميان جايگاه اتصال ماده راديواكتيو وجود ندارد هر چند كه با همين تغيير ايگاه نشاندارسازي برخي از پارامترهاي متدولوژيك دچار تغيير خواهند شد. چنانچه آنتي‌ژن با ماده راديواكتيو نشاندار شود، سنجش را RIA (Radio Immuno Assy) مي‌نامند.
اساس روش RIA رقابت ميان آنتي‌ژن نشاندار و آنتي ژن موجود در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتي‌بادي است. از آنجايي كه هر قدر ميزان آنتي‌ژن موجود در نمونه سنجش بيشتر باشد، آنتي‌ژن راديواكتيودار كمتري به آنتي بادي متصل ميشود، ميزان كمپلكس راديواكتيو با آنتي‌ژن غير راديواكتيو رابطه معكوس دارد.
از آنجايي كه تماس ماده راديواكتيو با سطح پوست بدن گرما و سوزش ايجاد مي‌كند، لذا برخي محققان آنتي‌ژن راديواكتيودار را آنتي‌ژن گرم و آنتي‌ژن غيرراديواكتيو را آنتي‌ژن سرد ناميده، اساس RIA را رقابت بين آنتي‌ژن سرد و گرم مي‌دانند.
اين روش سه جزء اصلي دارد: آنتي‌بادي، آنتي‌ژن سرد و آنتي ژن گرم.
با توجه به اينكه آنتي‌بادي بر عليه شاخص‌هاي مختلف آنتي‌ژن، توليد خواهد شد آنتي‌بادي مذكور را كه محصول كلون‌هاي مختلف سلولي است، آنتي‌بادي پلي كلونال مي‌گويند. با پيشرفت تكنيك هيبريدوما امروزه آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال ويژه‌اي براي سنجش انواع آناليت‌ها در دسترس است. لازم به يادآوري است كه به اشتباه برخي افراد آنتي‌بادي منوكلونال را ويژه‌تر از آنتي‌بادي پلي كلونال مي‌دانند در حالي كه الزاماً رابطه مستقيمي ميان ويژگي و نوع آنتي‌بادي وجود ندارد. يعني آنتي‌بادي منوكلونال مي‌تواند ويژگي برابر، كمتر و يا بيشتر از آنتي‌بادي پلي كلونال داشته باشد، هر چند در اغلب سنجش‌ها ما از آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال ويژه استفاده ميشود.
اما لفظ منوكلونال فقط گوياي اين مطلب است كه آنتي‌بادي مذكور از يك كلون سلولي ترشح شده است. چنانچه كلون مذكور برعليه شاخص آنتي‌ژني ويژه‌اي تشكيل شده باشد، آنتي‌بادي مذكور نيز ويژه خواهد بود. در مورد آنتي‌ژن گرم همواره دو حالت وجود دارد:
در حالت اول اتم راديواكتيو به صورت طبيعي در ساختمان آنتي‌ژن وجود دارد با اين تفاوت كه اتم مذكور در آنتي‌ژن سرد راديواكتيو نيست ولي در آنتي‌ژن گرم ايزوتوپ راديواكتيو آن به‌كار رفته است. مثلاً هورمون تيروكسين يا T4 در ساختمان خود داراي چهار اتم يد است.
در سيستم RIA آنتي‌ژن گرم براي مثال بالا همان مولكول T4 است، با اين تفاوت كه به جاي يد طبيعي از ايزوتوپ راديواكتيو آن يعني يد 125 استفاده شده است. در حالت دوم اتم راديواكتيو در ساختمان آنتي‌ژن طبيعي يا آنتي‌ژن سرد وجود ندارد. مثلاً در سنجش RIA هورمون انسولين، طي يك واكنش شيميايي يد 125 را روي حلقه‌هاي تيروزين ساختمان انسولين جاي مي‌دهند؛ لذا حلقة تيروزين در ساختمان آنتي‌ژن سرد فاقد اتم يد است در حالي كه در آنتي‌ژن گرم داراي اتم يد راديواكتيو است در حالت اول از لحاظ ساختمان شيميايي تفاوتي ميان آنتي‌ژن سرد و گرم وجود ندارد اما در حالت دوم بايد مراقب بود تا افزايش ماده راديواكتيو شاخص آنتي‌ژني آناليت را تحت تأثير قرار ندهد، زيرا اين امر مي‌تواند واكنش آنتي‌ژن و آنتي‌بادي را كه اساس روش سنجش است، متأثر سازد.
به طور كلي در روش RIA، آنتي‌ژن سرد و آنتي‌ژن گرم بر سر اتصال به مقدار معين و محدودي از آنتي‌بادي با هم رقابت مي‌كند. با توجه به اينكه اساس اين روش رقابت است و رقابت در محدوديت معنا مي‌يابد، لذا به اين روش، معرف محدود (Restricted Reagent) نيز مي‌گويد. در اين روش ابتدا رقابت ميان مقادير متفاوت و معيني (استاندارد) از آنتي‌ژن سرد با مقدار معين و ثابتي از آنتي‌ژن گرم بر سر اتصال مقدار معين و محدودي از آنتي‌بادي ايجاد ميشود كه ماحصل آن به دست آمدن منحني استاندارد است.
با توجه به رابطة معكوس ميان كمپلكس راديواكتيو و ميزان آنتي‌ژن سرد، همواره منحني‌هاي استاندارد شكلي نزولي دارد. در منحني استاندارد هميشه محور xها نشان‌دهندة غلظت آنتي‌ژن سرد و محور y ها نشان‌دهنده ميزان كمپلكس راديواكتيو بر حسب CPM (Count per Minute) است. همان‌طور كه مي‌دانيد راديواكتيويته و ناپايداري هسته برخي از ايزوتوپ‌هاي اتمي يك پارامتر ثابت فيزيكي است و همانگونه كه در اساس روش RIA ذكر شد ميزان آنتي‌ژن گرم، همواره ثابت و معين است.
بنابراين ميزان راديواكتيويته تمام غلظت‌هاي استاندارد با هم برابر بوده، همواره منحني استاندارد به صورت خطي موازي محور xها خواهد بود. يعني به‌‌رغم اينكه ميان كمپلكس راديواكتيو در هر غلظت استاندارد متفاوت است اما ميزان راديواكتيويته كل هر نقطه استاندارد با ساير نقاط برابر است، لذا در اين مرحله نيازبه جداسازي آنتي‌ژن گرم از كمپلكس راديواكتيو وجود دارد. مرحله جداسازي با روش‌هاي متفاوتي امكان‌پذير است ذكر جزئيات آن از حوصله اين مقاله خارج است.
بعضي از اين روش‌ها عبارتند از: استفاده از آنتي‌بادي دوم، استفاده از محلول‌هاي پليمري مانند PEG، استفاده از تثبيت آنتي‌بادي‌ها، استفاده از ذرات مغناطيس و ...
پس از مرحله جداسازي رابطه معكوس بين غلظت آنتي‌ژن سرد و كمپلكس راديواكتيو مي‌تواند مبناي سنجش آنتي‌ژن موجود در نمونه مورد بررسي باشد. يعني مي‌توان از ميزان كمپلكس راديواكتيوي كه در مجاورت آنتي‌ژن سرد مجهول تشكيل مي‌گردد با استفاده از منحني استاندارد به ميزان آنتي‌ژن سرد پي برد.
در هر حال، امروزه اغلب روش‌هاي IRMA به صورت غيررقابتي و ساندويچي اجرا مي‌گردند. يعني آناليت توسط دو آنتي‌بادي ساندويچ مي‌گردد كه يكي از اين آنتي‌بادي‌ها توسط ماده راديواكتيو نشاندار شده است. در اين روش به ازاي هر آناليت يك ساندويچ نشاندار تشكيل مي‌گردد، لذا رابطه مستقيم ميان آناليت و كمپلكس راديواكتيو برقرار است.
در عمل، ابتدا به ازاي مقادير معين آناليت (استانداردها) كمپلكس‌هاي راديواكتيو تشكيل مي‌گردد. غلظت آناليت روي محور x ها و ميزان كمپلكس راديواكتيو (CPM) روي محور yها قرار گرفته و بدين ترتيب منحني صعودي كه نشانه رابطه مستقيم غلظت آناليت با كمپلكس راديواكتيو است، تشكيل مي‌گردد.بر اساس ميزان كمپلكس راديواكتيو در نمونه‌هاي مجهول و استفاده از منحني فوق، غلظت آناليت مجهول محاسبه مي‌گردد.
مزاياي روش RIA به IRMA
1- در روش RIA مولكول‌هاي آنتي‌ژن اغلب از جنس هاپتن (مولكول‌هايي با جرم مولكولي كمتر از 1000 دالتون) است. مانند انواع هورمون‌هاي استروئيدي، داروها، هورمون‌هاي تيروئيدي و ... محدوديت گروه‌هاي عامل (Functional Group) در مولكول‌هاي مورد نظر، نشاندارسازي را محدود ساخته، اغلب نياز به واكنش‌هاي تخصصي و پيچيده دارد، اما در روش IRMA هميشه نشاندارسازي روي مولكول پروتئين بزرگ آنتي‌بادي انجام مي‌گيرد. اين مولكول بزرگ داراي انواع گروه‌هاي عملكردي است كه به‌راحتي با روش‌هاي ساده و عمومي مي‌توان آنها را نشاندار ساخت،
2- يكي از پارامترهاي متودولوژيك، ويژگي (Specificity) است. در روش RIA با استفاده از يك آنتي‌بادي، شناسايي منفرد (Single recognition) صورت مي‌گيرد، در حالي كه در روش IRMA استفاده از دو آنتي‌بادي منوكلونال ويژه، ويژگي را افزايش مي‌دهد،
3- حساسيت همواره يكي از مشخصات مهمي است كه در طراحي روش‌هاي مدنظر محققان قرار مي‌گيرد. در روش RIA اساس، رقابت بوده در يك محدوده معين از غلظت رابطه‌اي ميان نسبت رقابت و كملپكس راديواكتيو وجود دارد، لذا حساسيت IRMA به دليل وجود رابطه يك به يك ميان آناليت و كمپلكس رايدواكتيو از RIA بيشتر است. در روش IRMA جايگاه‌هاي نشاندارسازي بالقوه از روش RIA بيشتر است، لذا تعداد سيگنال‌هاي دريافتي يا به عبارتي حساسيت بالاتر مي‌رود. در پيشرفت دستگاهي، چنانچه دستگاه حساس‌تري طراحي شود به طوري كه به CPMهاي پايين حساسيت بيشتري داشته باشد، در روش RIA به خوانش غلظت‌هاي پايين ياري مي‌رساند و مي‌دانيد كه حساسيت با غلظت‌هاي پايين مرتبط است،
4- واكنش آنتي ژن و آنتي‌بادي يك واكنش تعادلي غيركووالاني بوده، اندازه‌گيري در نقطه تعادل، دقيق و تكرارپذير است. لذا در كليه روش‌هاي سنجش ايمني زماني به‌نام زمان انكوباسيون مطرح است. در واقع اين زمان براي به تعادل رسيدن واكنش در نظر گرفته شده است. در روش IRMA به دليل اينكه اغلب رقابت وجود ندارد، براي حصول اطمينان از كفايت آنتي‌بادي‌ها براي تشكيل كمپلكس غلظت‌هاي بالاي آناليت، همواره مقدار زيادي از آنتي‌بادي‌ها به كار مي‌رود،
در روش IRMA به دليل معرف مازاد، طبق اصل لوشاتليه تعادل به سمت تشكيل كمپلكس جابه‌جا ميشود. لذا غلظت بالاي مواد اوليه سرعت به تعادل رسيدن يا زمان انكوباسيون را كاهش مي‌دهد. بنابراين يكي ديگر از مزاياي روش IRMA نسبت به RIA كاهش زمان انكوباسيون است،
5- محدوده قابل اندازه‌گيري آناليت را محدوده عملكرد روش مي‌گويند. اين محدوده فاصله بين اولين و آخرين نقطه استاندارد است. در روش RIA مبنا رقابت است و هميشه در محدوده معيني از غلظت‌ها رقابت معنا دارد، ولي در IRMA به ازاي هر آناليت يك كمپلكس سيگنال‌دهنده تشكيل ميشود، لذا محدوده عملكرد در IRMA حدود 100 برابر بيشتر از RIA است،
6- در روش RIA كليه مراحل نمونه‌برداري از نمونه، استاندارد، كنترل و محلول نشاندار داراي اهميت بوده، در دقت كل روش سهيم است. روش IRMA همان‌طور كه ذكر شده يك روش معرف مازاد است و مرحله افزودن آنتي‌بادي كونژوگه تأثير كمتري نسبت به همين مرحله در RIA دارد. لذا در كل، دقت مرحله نمونه‌برداري در IRMA وابستگي كمتري نسبت به RIA دارد و اين يكي ديگر از مزاياي IRMA محسوب ميشود و
7- مقاومت روش در برابر شرايط آزمايش يكي ديگر از پارامترهاي روش‌شناسي است. در IRMA بيشتر از RIA از آنتي‌بادي مونوكلونال استفاده ميشود. در مورد آنتي‌بادي مونوكلونال مي‌توان شرايط محيطي از لحاظ PH، قدرت يوني و ... را طوري تنظيم كرد كه شرايط ايده‌آل تأمين شود اما در آنتي‌بادي‌هاي پلي كلونال انتخاب شرايط خاص براي گروهي از آنتي‌بادي‌ها مطلوب و براي برخي ديگر غيرمطلوب است. لذا اين شرايط براي گروهي از آنتي‌بادي‌ها به مرور زمان مضر بوده، در حقيقت مقاومت روش IRMA نسبت به RIA در برابر شرايط آزمايش بيشتر است.
در ادامه به برخي از محدوديت‌ها و معايب روش‌هاي سنجش ايمني راديواكتيو اشاره ميشود:
1- خطر تشعشع، و خطر تشعشع هر چند ناچيز،
2- نياز به امكانات حفاظتي در برابر پرتوها،
3- توليد زباله‌هاي راديواكتيو،
4- محدود بودن زمان انقضاء كيت‌ها به دليل نيمه‌عمر كوتاه
5- محدوديت اتوماسيون
اساس روش سنجش‌هاي ايمني آنزيمي
اساس اين روش‌ها مانند سنجش‌هاي ايمني راديواكتيو همان واكنش آنتي‌ژن- آنتي‌بادي است، با اين تفاوت كه جهت رديابي واكنش مذكور به جاي راديواكتيويته از آنزيم‌ها و واكنش‌هاي آنزيمي استفاده ميشود.
در اين روش نيز مي‌توان جهت رديابي واكنش، آنتي‌ژن و يا آنتي‌بادي را با آنزيم نشاندار ساخت. به عمل نشاندارسازي، كونژوگاسيون و به مولكول آنزيم‌دار، كونژوگه آنزيمي مي‌گويند. چنانچه آنتي‌ژن كونژوگه گردد روش EIA (Enzyme Immuno Assay) گويند و اگر آنتي بادي كونژوگه گردد روش را IEMA (Immuno Enzymo Meteric Assay) ناميده ميشود.
اساس روش EIA، رقابت ميان آنتي‌ژن كونژوگه و آنتي‌ژن آزاد در نمونة مورد سنجش بر سر اتصال به آنتي‌بادي است. در اينجا نيز ميزان كمپلكس آنزيم‌دار با آنتي‌ژن آزاد رابطه معكوس دارد. لذا مي‌توان بسته به نياز از آنتي‌بادي‌هاي پلي كلونال يا مونوكلونال استفاده كرد.
البته در برخي سنجش‌ها آنتي‌بادي‌هاي اليگو كلونال پاسخ بهتري ايجاد مي‌كند. (چنانچه چند نوع آنتي‌بادي مونوكلونال را با هم مخلوط كنيم، مجموعه حاصله را آنتي‌بادي اليگوكلونال مي‌نامند).
يكي از تفاوت‌هاي RIA با EIA در اين است كه اغلب، آناليت راديواكتيودار از لحاظ ساختمان شيميايي و ابعاد فيزيكي با آناليت سرد يكسان بوده يا تفاوت ناچيزي دارد اما در EIA آناليت كونژوگه به آنزيم (كه اغلب مولكول‌هاي پروتئيني بزرگي است) متفاوت است، لذا نوع آنتي‌بادي به‌كار رفته و شرايط سنجش خصوصاً زمان انكوباسيون به‌گونه‌اي طراحي ميشود كه اين تفاوت ساختمان و ابعاد بر واكنش آنتي‌ژن- آنتي‌بادي اثر سوء به جاي نگذارد. انواع روش‌هاي ايمني آنزيمي عبارتند از:
1- EIA رقابتي براي آنتي‌ژن: در اين روش آنتي‌ژن كونژگه و آنتي‌ژن آزاد بر سر اتصال به آنتي‌بادي مشترك با يكديگر رقابت مي‌كند. پس از جداسازي كمپلكس آنزيم‌دار از كونژوگه ازاد، فعاليت آنزيمي مبناي سنجش قرار مي‌گيرد. در اينجا نيز رابطه معكوس ميان كمپلكس آنزيمي و آناليت آزاد وجود دارد. ابتدا واكنش آنزيمي مربوط به كمپلكس آنزيمي در حضور مقادير معيني از آناليت آزاد (استانداردها) بررسي شده، محور xها نشان‌دهنده غلظت آناليت آزاد و محور yها مؤيد فعاليت كمپلكس آنزيم‌دار بر حسب جذب نوري (OD) است. منحني استاندارد، نزولي رسم شده و بر اساس آن ميزان آناليت در نمونه‌هاي مجهول سنجيده ميشود،
2- IEMA براي آنتي‌ژن: ابتدا آنتي‌ژن با مقادير مازاد آنتي‌بادي نشاندار واكنش مي‌دهد. سپس مقادير مازاد آنتي‌ژن تثبيت شده به محيط افزوده ميشود تا با مابقي آنتي‌بادي وارد واكنش شود با جداسازي آنتي‌ژن‌هاي تثبيت شده و سنجش فعاليت آنزيمي متصل به آنتي‌ژن محلول، مي‌توان ميزان آنتي‌ژن را مشخص كرد. در اينجا نيز سيستم رقابتي نبوده، ميزان فعاليت آنزيمي مشاهده شده با ميزان آناليت آزاد رابطه مستقيم دارد.
3- IEMA ساندويچي براي آنتي‌ژن: در اين روش آنتي‌ژن يا آناليت مذكور بايد حداقل دو شاخص آنتي‌ژنيك مجزا و دور از هم داشته باشد. آنتي‌ژن طي يك يا در مواردي طي دو مرحله توسط آنتي‌بادي اول و آنتي‌بادي كونژوگه دوم ساندويچ ميشود. پس از جداسازي آنتي‌بادي كونژگه مازاد كه در واكنش شركت نكرده، فعاليت كمپلكس ساندويچي آنزيم را اندازه‌گيري مي‌كند. در اين واكنش نيز به ازاي هر آناليت يك ساندويچ آنزيم‌دار تشكيل شده، رابطه مستقيم بين ميزان آناليت و فعاليت كمپلكس آنزيم‌دار وجود دارد،
4- IEMA ساندويچي براي آنتي‌بادي: در اين روش آنتي‌بادي مورد سنجش بين آنتي‌ژن تثبيت شده و آنتي‌بادي دوم عليه آنتي‌بادي مورد سنجش ساندويچ ميشود، آنتي‌بادي دوم با آنزيم نشاندار شده است. پس از انكوباسيون و شست‌وشو فعاليت ساندويچ آنزيم‌دار را با افزودن سوبسترهاي مناسب آنزيم‌دار اندازه‌گيري مي‌كنند و ميزان فعاليت آنزيم با غلظت آنتي‌بادي مورد سنجش رابطه مستقيم دارد،
5- الايزاي هوموژن: همان‌طور كه اشاره شد نياز به اندازه‌گيري روزمره و تعداد بالاي برخي درخواست‌ها، بحث اتوماسيون را مطرح نمود. يكي از شرايط كمك‌كننده براي اتوماسيون هوموژن بودن سيستم است، يعني سيستم سنجش نيازي به مراحل جداسازي مانند سانتريفيوژ كردن ندارد و فعاليت آنزيم برخلاف راديواتيويته مي‌تواند در حالت آزاد و متصل متفاوت باشد، مثلاً اتصال آنتي‌ژن به آنتي بادي سبب فعاليت يا مهار فعاليت آنزيم متصل به كمپلكس گردد، لذا نيازي به مرحله جداسازي نيست و
6- ساير روش‌هاي الايزا: در سيستم‌هاي الايزا مي‌توان آنتي‌بادي و آنزيم‌دار و آنتي‌بادي آزاد را در اتصاف به آنتي‌ژن به رقابت گذاشت يا آنتي‌بادي و آنتي‌ژن آنزيم‌دار را وارد واكنش نمود و سپس آنتي‌بادي تثبيت شده را جهت جمع‌آوري آنتي‌ژن آنزيم‌دار مازاد به محيط افزود و پس از جداسازي، فعاليت آنزيمي را در محلول يا در فاز تثبيت شده مورد سنجش قرار داد.
در حالت اول رابطه مستقيم و در حالت دوم رابطه معكوس است.
در سنجش‌هاي آنزيمي به‌طور عمده از آنزيم پراكسيد از (HRP) و فسفاتاز قليايي (ALP) استفاده ميشود اما مي‌توان از هر نوع آنزيمي كه فعاليت ويژه آن بالا باشد، به فرم خالص و ارزن قابل تهيه باشد، جايگاه‌هاي مناسب جهت كنژوگاسيون پايدار به آنتي‌ژن يا آنتي بادي را داشته باشد و اندازه‌گيري ميزان فعاليت آنها در آزمايشگاه‌هاي معمولي ميسر باشد، بهره گرفت. البته هيچ‌كدام از اجزاء واكنش آنزيمي ترجيحاً نبايد سمي و خطرناك باشد.
كليه مزايايي كه IRMA بر RIA دارد در مورد IEMA بر EIA نيز حاكم است، لذا از تكرار جزئيات آن خودداري ميشود.
مزاياي IEMA نسبت به EIA:
سادگي نشاندار كردن، افزايش حساسيت، ويژگي بالاتر، سرعت بيشتر واكنش، محدوده وسيع‌تر از غلظت آناليت و مقاومت بيشتر در برابر شرايط آزمايش.
مزاياي روش‌هاي سنجش ايمني آنزيمي به روش‌هاي سنجش ايمني راديواكتيو
عدم وجود خطر تشعشع
قيمت ارزان‌تر دستگاه‌ها
معرف‌هاي ارزان
نيمه‌عمر طولاني كيت‌هاي آنزيمي،
امكان اتوماسيون،
سرعت خوانش بالا:
امكان افزايش حساسيت روش.
سنجش‌هاي نشاندار آنزيمي علاوه بر امكان رديابي، امكان تقويت نيز دارد يعني واكنش آنزيمي، هر آناليت را به يك كمپلكس آنزيم‌دار و هر آنزيم را به ميليون‌ها تغيير در ماده اوليه يا محصول مرتبط مي‌سازد.
از آنجايي كه آنزيم‌هاي متفاوت، واكنش آنزيمي متفاوت و قابل رديابي ايجاد مي‌كند در يك نمونه مي‌توان با استفاده از ديا چند كونژوگه آنزيمي و پيگيري چند فعاليت آنزيمي، چند آناليت را به طور همزمان مورد سنجش قرار داد. هر چند فراهم آوردن شرايط يكسان براي فعاليت مناسب چند نوع آنزيم كار پيچيده‌اي است اما امكان‌پذير است و امكان سنجش همزمان سرعت آزمون‌ها و همچنين هزينه آنها را كاهش مي‌دهد.
محدوديت سنجش ايمني آنزيمي
سنجش ايمني آنزيمي داراي برخي محدوديت‌ها نيز هست:
1- همان‌طور كه اشاره شد، فعاليت راديواكتيو يك پارامتر ثابت فيزيكي است كه ميزان آن تحت تأييد شرايط محيطي مانند نور، درجه حرارت، آلودگي و ... قرار نمي‌گيرد اما واكنش آنزيمي تحت تأثير پارامترهاي مختلف قرار مي‌گيرد لذا رديابي راديواكتيو پايدارتر و آسان‌تر از اندازه‌گيري فعاليت آنزيمي است،
2- اجزاء مختلف موجود در نمونه مي‌توانند واكنش آنزيمي را تحت تأثير قرار دهد و
3- سيستم‌هاي هوموژن آنزيمي در حال حاضر فاقد حساسيت كافي بوده، در ضمن كاربرد آنها عمدتاً به هاپتن‌ها محدود شده است.
وجود محدوديت‌هاي فوق نظر محققان را به استفاده از ساير نشانگرها معطوف نموده است.
منابع:
1- اصول علمي الايزا، دكتر محمودجواد رسايي
2- آشنايي با مباني تئوري الايزا، دكتر مهدي هدايتي
3- ايمونولوژي رويت، ايوان رويت، مترجم: دكتر عطيه عبادي، سارا مظاهري
4- هيتوشيمي در پاتولوژي، دكتر فرخ قوام
مطالب مشابه :
دانلود فرم پروپوزال
دانلود فرم پروپوزال دانشگاه علوم پزشكي دانشگاه علوم پزشکی زنجان; دانشگاه علوم
فرم پروپوزال جشنواره پنجم دانشجو و تحقیق به همراه جدول زمانی
پایگاه تخصصی دانشجویان پرستاری و پرستاران دانشگاه علوم پزشکی فرم پروپوزال جشنواره
ايمني سنجي به چند روش- روش‌هاي مختلف سنجش ايمني و بررسي مزايا و معايب آنها
مشاوره پروپوزال دانشگاه علوم پزشكي زنجان باشد، به فرم خالص و
پایان نامه پروپوزال مقاله سمینار رشته علوم کتابداری واطلاع رسانی دکترا کارشناسی ارشد 09123600694
پروپوزال پایان نامه دانلود مدیریت بررسی رفتار اطلاع یابی پزشکان عمومی در دانشگاه علوم
رشته مدیریت دولتی چاپ و ویرایش مقاله،انجام فوری سمینار، مشاوره و اجرای پروپوزال پایان نامه0912360069
پروپوزال پایان در سازمانهای دولتی زنجان از نظر کیفیت در دانشگاه علوم
رشته تربیت بدنی مشاوره پایان نامه چاپ مقاله اجرای پروپوزال فوری 09123600694
پروپوزال پایان اول سایر رشته‌های دانشگاه زنجان تربیت بدنی دانشگاه های علوم
برچسب :
دانلود فرم پروپوزال دانشگاه علوم پزشكي زنجان