پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش اول)

پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش اول)

مقدمه

ارزشمند بودن مارکرهای DNA در امر اصلاح نباتات، بخصوص در مطالعات تنوع ژنتیکی و نقشه یابی ژن اثبات شده است. سیستم های معمول مارکری DNAمبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ، شامل DNA پلی مورف تکثیر یافته تصادفی (RAPD)، پلی مرفیسم طولی قطعه تکثیر شده (AFLP) و اخیرا تکرارهای توالی ساده یا ریز ماهواره ها (SSRs) می باشند. محدودیتهای اصلی این روشها، تکرارپذیری اندک رپید، هزینه بالای AFLP و نیاز به شناخت توالیهای پیرامونی برای توسعه پرایمرهای اختصاصی گونه ها برای پلی مرفیسمSSR است. ISSR-PCR تکنیکی است که بر اغلب این محدودیت ها غلبه می کند. این روش بسرعت بوسیله جامعه علمی رشته های مختلف اصلاح نبات مورد استفاده قرار گرفته است. این تکنیک در زمینه های تنوع ژنتیکی، مطالعات پلی ژنیک، نقشه یابی ژنوم و بیولوژی تکامل در طیف وسیعی از گونه های گیاهی بکار گرفته می شود. در این روش، SSRs بعنوان پرایمرهایی برای تکثیر بیشتر مناطق میان SSR استفاده می شوند. SSRs یا میکروستلایت ها تکرارهای پشت سرهم کوتاه (STRs) یا تعداد متنوعی از تکرارهای پشت سر هم (VNTRs) یک یا چهار باز حاضر در تمام مناطق ژنومهای یوکاریوتی هستند. آنها در سراسر ژنوم گسترده شده و از نظر تعداد واحدهای تکراری متفاوت هستند. جزئیات روش و کاربردهای اصلی آن در ادامه مورد بحث قرار خواهد گرفت.

تکنیک ISSR

تکنیک ISSR، یک روش مبتنی بر PCRاست که شامل تکثیر یک قطعه DNA حاضر در فاصله تکثیر پذیر میان دو ناحیه تکراری ریز ماهواره منحصر به فرد با جهات مخالف می باشد. این تکنیک، معمولا از میکروساتلیت‌ها (ریزماهواره‌های) با طول16-25 bp، بعنوان پرایمر یک واکنش تک پرایمری که لوکوس‌های چندگانه ژنومی را برای تکثیر توالی های بین ریزماهواره‌ای با اندازه‌های مختلف، هدف می‌گیرد بهره می برد. تکرارهای ریزماهواره مورد استفاده بعنوان پرایمر، می توانند دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی باشند. پرایمرهای مورد استفاده می توانند به هر نقطه ای از DNA متصل شوند اگرچه معمولا در انتهای 3’ یا 5’ خود به یک تا چهار باز متصل بوده و براساس آنها، گسترش می یابند (شکل 1). این تکنیک بیشتر مزایای AFLP و ریزماهواره را با جامعیت رپید ترکیب کرده است. تکرارپذیری بالایISSRs احتمالا به سبب استفاده از پرایمرهای طولانی تر (16–25 mers) در مقایسه با پرایمرهای کوتاهتر رپید (10- mers) می باشد که این امر امکان استفاده از دمای بالای اتصال(45 الی 60 درجه سانتیگراد) را فراهم می کند که منجر به افزایش احتمال اتصال پرایمر به نقاط مشخصی از DNA (تکرار پذیری بیشتر) می شود. مطالعات در مورد تکرار پذیری نشان می دهد که تنها ضعیف ترین باندها تکرار پذیر نیستند. در حدود 95-92 درصد قطعات امتیاز داده شده می توانند در طول نمونه های DNA رقم و در طول دوره های مجزای PCR تکرار شوند وقتی با استفاده از پلی اکریل آمید شناسایی شدند.10 نانوگرم DNA الگو، همان محصولات تکثیری را که 25 و یا50 نانوگرم DNA الگو در هر 20 میکرولیتر PCR تولید می کنند، تولید خواهد کرد. دمای اتصال به درصد پرایمر مورد استفاده بستگی دارد و معمولا از 45 تا 65 درجه سانتیگراد است.

ISSRs عمدتا بعنوان مارکرهای غالب، تابع توارث پذیری ساده مندلی شناخته می شوند. اما، آنها همچنین در برخی موارد بعنوان مارکرهای همبارز شناخته شده اند چرا که قادر به تمایز میان هموزیگوت‌ها و هتروزیگوت‌ها بوده اند.

شکل 1- ISSR-PCR : تصویر شماتیک یک پرایمر منفرد (AG)8، (a) غیر متصل (آزاد)، (b) متصل به نوکلئوتید در انتهای 3’، (c) متصل به نوکلئوتید در انتهای5’ ، که تکرار (TC)n را، برای تکثیر منطقه توالی ساده تکراری در برگرفته شده بوسیله دو توالی معکوس (TC)n در دو رشته الگو و پیرو، هدف گرفته است. (a) پرایمر غیر متصل (AG)n، می تواند به هر نقطه ای در ناحیه تکراری (TC)n رشته الگو متصل شده و منجر به لغزش و در نهایت تشکیل اسمیر می شود. (b) پرایمر (AG)n متصل به دو نوکلئوتید (NN) در انتهای 3’ خود، به منطقه خاصی از رشته الگو متصل شده و باندهای واضح تولید می کند. (c) پرایمر (AG)n متصل به دو نوکلوتید(NN) در انتهای 5’خود، به منطقه خاصی از رشته الگو متصل شده و بخشی از ناحیه تکراری را تکثیر می کند که منجر به تولید باندهای بزرگتر می شود.

منبع تغییر پذیری/ پلی مرفیسم

میزان تغییر در (توالی) ریز ماهواره ها بطور چشمگیری، بیش از دیگر انواع DNAاست. بنابراین احتمال پلی مرفیسم در این توالیها بیشتر است. منبع تغییر پذیری در ISSRs می تواند مرتبط به هریک از دلایل پیش رو یا ترکیبی از آنها باشد.

DNA-1 الگو

لغزش (خطای) DNA پلیمراز در طی تکثیرDNA و شکست در تصحیح اتصالات اشتباه (mismatches)، بعنوان مکانیسم تغییر پذیری بیش از حد SSRsدانسته می شود. موتاسیون در مکان پرایمینگ بعبارت دیگرSSR، می تواند از تکثیر یک قطعه ممانعت کند (همچون مارکرهای رپید)، و بنابراین پلیمرفیسم حاضر/ غایب را ارائه می دهد. پدیده حذف/ ورود نوکلئوتیدها در درون ناحیه SSRیا ناحیه تکثیر شده، بسته به قابلیت تکثیرپذیری اندازه قطعه حاصل، منجر به حذف یک محصول یا پلی مرفیسم طولی می شود. تغییر پذیری تعداد نوکلئوتیدها در درون یک تکرار ریزماهواره، وقتی یک پرایمر متصل به 5’ استفاده می شود، منجر به پلی مرفیسمهای طولی می شود.

2-طبیعت پرایمر مورد استفاده

توسعه پلی مرفیسم همچنین بنابر طبیعت پرایمر (پرایمر آزاد و یا پرایمر متصل به نوکلئوتید در انتهای 3’ و یا 5’) و توالی تکرارها در پرایمر مورد استفاده تغییر می کند. وقتی پرایمرهای غیرمتصل، بعبارت دیگر تنها SSRs،بعنوان پرایمر مورد استفاده قرار می گیرند، پرایمر تمایل به لغزش در درون واحدهای تکراری در طی تکثیر دارد که منجر به تولید اسمیر، بجای باندهای شفاف، می شود. اتصال یک تا چهار نوکلئوتید به انتهای 3’ و یا 5’ پرایمر (پرایمرمتصل به نوکلئوتید)، این اطمینان را می دهد که پرایمر فقط با انتهاهای ریزماهواره در DNAالگو اتصال می یابد و بنابراین از پرایمینگ درونی و تشکیل اسمیر ممانعت می شود. همچنین، اتصال نوکلئوتید سبب می شود که تنها یک زیر مجموعه از میکروستلایت ها، بعنوان محل های پرایمینگ مورد استفاده قرار بگیرند. وقتی پرایمرهای متصل به نوکلئوتید در انتهای 5’استفاده می شوند، محصولات تکثیر شده شامل توالی های ریز ماهواره و انواع طولی آنها در طول یک ژنوم هستند بنابراین تعداد بیشتری باند و درجه بالاتری از پلی مرفیسم را ارائه می کنند. معمولا پرایمرهای با تکرارهای دو نوکلئوتیدی و متصل به نوکلئوتید در انتهای3’ و یا 5’، پلیمرفیسم بالایی را نشان می دهند. پرایمرهای متصل به نوکلئوتید در انتهای 3’، الگوی باند دهی واضح تری را در مقایسه با پرایمرهای متصل به نوکلئوتید در انتهای 5’ ارائه می کنند. از آنجا که پرایمر یک موتیف SSRاست تناوب و توزیع موتیف های ریزماهواره، موتیف ها را در گونه های مختلف تکرار می کند، همچنین بر تولید باندها تاثیر می گذارد. میان توالی های DNAاندامک ها و هسته از نظر فراوانی SSRsتفاوت وجود دارد. با بکارگیری پرایمرهای دو و سه نوکلئوتیدی با یکدیگر، یک SSRدر هر 33Kbتوالی DNAهسته، در مقایسه با هر 423Kbاز توالی DNAاندامک، یافت شد. بطور کلی، پرایمرهای با تکرارهای (AG), (GA), (CT), (TC), (AC), (CA) پلی مرفیسم بیشتری نسبت به پرایمرهای با دیگر تکرارهای دو یا سه نوکلئوتیدی نشان می دهند. تکرارهای (AT) فراوانترین دو نوکلئوتیدها در گیاهان هستند اگرچه پرایمرهای مبتنی بر(AT)، خوداتصال بوده و DNA را تکثیر نمی کنند. پرایمرهای با تکرارهای سه و چهار نوکلئوتیدی کمترین فراونی را داشته و استفاده از آنها در ISSRsکمتر از پرایمرهای با تکرارهای دو نوکلئوتیدی است. (AG) و پرایمرهای مبتنی بر آن، باندهای شفافی در برنج، پرتقال سه برگی، Douglas fir and sugi و نخود تکثیر کرده اند، در حالیکه پرایمرهای مبتنی بر تکرارهای دو نوکلئوتیدی (AC)،در گندم و سیب زمینی مفیدتر دانسته شدند. قدرت تفکیک(Rp)، شاخص پیشرفته مقایسه ارزش پرایمرهای مختلف، برپایه باندهای آگاهی بخش حاصل در یک مجموعه ژرم پلاسم است.

3-روش تشخیص

میزان پلیمرفیسم شناسایی شده بسته به نوع روش شناسایی، متفاوت است. الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) در ترکیب با نوکلئوتید رادیو اکتیویته (نوکلئوتید لیبل گذاری شده در واکنشPCR) ، و متعاقب آن رنگ آمیزی با نقره، حساس ترین سیستم شناسایی بوده و پس از آن سیستم آگارز-بروماید اتیدیوم حساسترین است. وقتی ژل پلی اکریل آمید استفاده شد، نسبت به ژل آگارز، باندهای مشخصا بیشتری به ازای هر پرایمرحاصل شد. در یک مطالعه بر ژوم پلاسم پرتقال سه برگی، رنگ آمیزی نقره با استفاده از مواد شیمیایی با کیفیت بالا توانست همه باندهای شناسایی شده توسط اتورادیو گرافی را شناسایی کند. اما سطوح بالای پلی مرفیسم ISSR،حتی وقتی محصولات تکثیر، بدون لیبل گذاری با مواد رادیو اکتیو بر ژلهای آگارز تفکیک شدند، نیز شناسایی شد. بنابراین، نیاز به مواد رادیواکتیویته، وقتی نمونه های زیادی باید از نظر یک خصوصیت خاص در ژرم پلاسم اسکرین شوند، قابل اجتناب است.

ISSR-PCR یک تکنیک ساده، سریع و موثر بوده و بسیار تکرار پذیر است. استفاده از مواد رادیواکتیویته ضروری نیست. پرایمرها، برخلاف SSR-PCR، اختصاصی نیستند و می‌توانند بوسیله هر کسی سنتز شوند. تنوع طول، موتیف و اتصال پرایمر، میسر است. پرایمرهای طویل (16–25 bp)، قید و بند بیشتری ایجاد می‌کنند (تنها به شمار معدودی از توالی‌های DNA می‌توانند متصل شوند). محصولات تکثیر شده (مارکرهایISSR) معمولا bp 2000-200 طول داشته و به هر دو سیستم تشخیص بوسیله الکتروفورز ژل آگارز و پلی اکریل آمید پاسخ می دهند. در مقالات این تکنیک و انواع آن به نامهای مختلف خوانده شده اند.

پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش اول)

مطالب مشابه :

طرح توجیهی اقتصادی زنبور عسل و برآورد هزینه ها

انواع قفس پرورش طیور

بیوگرافی پروژه

طرح توجیهی فنی ، مالی و اقتصادی (پرورش گـاو شیری با ظرفیت پنجاه راس)

سؤالات متن در س یک ساختمان بدن موجودات زنده

طرح توجیه فنی ، مالی و اقتصادی، طیور گوشتی با ظرفیت 100000 قطعه

طرح توجیهی فنی ، مالی و اقتصادی (پرورش ماهی قزل‌آلا)

پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش اول)

دانلود طرح توجیهی,طرح توجیهی تولیدی,طرح توجیهی کشاورزی,طرح توجیهی خدماتی,تهیه طرح توجیهی,Comfar

پرسشها و پاسخها در خصوص بیماری هاری