مقدمه

به سبب این که ماکرومولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها ها، دارای بار هستند؛ می‌‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی به نام الکتروفورز استفاده می‌‌شود. الکتروفورز در واقع مهاجرت یون ها در یک میدان الکتریکی است روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه ی بیومولکول ها (مولکول های زیستی)، اعم از اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها ابداع شده است و به این منظور، از ژل های مختلفی چون ژل های اکریل آمید، ژل های نشاسته، ژل های آگار و آگاروز و ژل های کاغذی استفاده می شود. به دلیل این که ژل های کاغذی امروزه کاربرد کمتری از انواع دیگر دارند؛ و ژل های نشاسته بیشتر برای جداسازی ایزوزایم ها استفاده می شوند؛ در این نوشتار دو ژل پرکاربرد در تفکیک قطعات  DNA و RNA، یعنی ژل های اکریل آمید و آگاروز، معرفی و مورد بررسی قرار می گیرند.

الکتروفورز ژل

از یک محیط نیمه جامد (ژل)، به عنوان فاز ثابت استفاده می‌‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده، به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌‌شود.

الف) الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE)

الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالایی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌‌شود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، پس از ایجاد میدان الکتریکی، پروتئین ها به حرکت در می آیند و طول ژل را طی می کنند. اما به طور معمول بار مؤثر در ایجاد حرکت، بار خود پروتئین نیست؛ بلکه بار ماده ای است به نام SDS که مولکول بزرگ شوینده ای با بار منفی است؛ که به طور معمول الکتروفورز پروتئین ها در حضور آن انجام می‌‌شود. ترکیب پروتئین + SDS از میان حفره های شبکه ی پلی اکریل آمید عبور کرده، طول ژل را طی می کند. مولکول های کوچک تر سریع تر از مولکول های بزرگ حرکت می کنند؛ زیرا درصد بیشتری از منافذ، مولکول های کوچک را از خود عبور   می دهند. SDS باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می‌‌شود (در صورتی که نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد؛ از مواد واسرشت کننده نظیر اوره یا فرمالدهید در ژل، هم زمان با الکتروفورز استفاده می‌‌شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابر این، تفکیک مولکول ها فقط براساس طول - و نه ساختار دوم- انجام می‌‌شود. در این ژل ها مولکول های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر، سریع تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌‌کنند). به ازای هر 2 اسید آمینه، 1 مولکول SDS به پروتئین متصل می‌‌شود که باعث القای بار منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌‌شود. در پایان، پروتئین ها یا قطعات DND با وزن مولکولی بالا، در بالای ژل اکریل آمید و آنهایی که وزن مولکولی (برحسب دالتون)، کوچک تری دارند؛ در پایین ژل قرار می گیرند. در واقع یک رابطه ی خطی بین میزان حرکت مولکول ها روی ژل، و وزن مولکولی آنها وجود دارد. از سوی دیگر هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد؛ قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌‌نماید. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی DNA استفاده می‌‌شود.

محاسن ژل اکریل آمید

1. چون اندازه ی منافذ ژل اکریل آمید یکسان است؛ در نتیجه اثر غربال سازی حاصل از این خاصیت، باعث افزایش قدرت وضوح این نوع ژل ها می شود.

2. به دو طریق می توان به سادگی ژل هایی با اثرات غربال سازی متفاوت ایجاد نمود: الف) تغییر غلظت اکریل آمید ب) تغییر نسبت اکریل آمید به بیس اکریل آمید.

3. برخلاف ژل هایی مثل ژل های نشاسته، ژل اکریل آمید ترد و شکننده نیست.

4. ژل اکریل آمید شفاف بوده و نگه داری آن آسان است.

5. چون به صورت شیمیایی تهیه می شود؛ می تواند به صورت بسیار خالص تولید گردد.

معایب ژل اکریل آمید

1. نمی توان آنها را مثل ژل های نشاسته، به چندین لایه برش داد؛ پس با این ژل امکان مطالعه ی همزمان چند سیستم وجود ندارد.

2. در pH زیر 5/6، بستن ژل بسیار طولانی و وقت گیر می شود.

3. ژل اکریل آمید، سمی و سرطان زا است؛ و در بافت های بدن تجمع یافته، روی اعصاب تأثیر سوء می گذارد.

4. روشی بسیار گران است؛ به نحوی که دستگاه الکتروفورز ژل اکریل آمید، 3 تا 5 برابر گران تر از دستگاه الکتروفورز با ژل نشاسته می باشد.

ب) الکتروفورز ژل آگاروز

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می‌‌شود که آلکالوئیدی است که از جلبک ها تهیه می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریع تر و آسان تر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه ی کمتری دارد. به طور معمول برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ تر از500 جفت باز)، در صورتی که هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد؛ استفاده از ژل آگاروز، انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای، از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌‌شود.

محاسن ژل آگاروز

1. ارزان قیمت است.

2. نگه داری و تهیه ی آن آسان است.

3. شفافیت بالایی دارد.

4. روشی سریع می باشد (25 تا 30 دقیقه).

5. غیر سمی بوده و برای کاربر و طبیعت، بی خطر است.