در قسمت های قبل 3 نوع از حاملین یا ناقل های ژنی مورد استفاده در باکتری اشرشیاکولی که شامل پلاسمید باکتریای، فاژ لاندا و فاژ M13 بود را معرفی کردیم.

در بیشتر مطالعات ژنتیکی و زیست مولکولی مثل مطالعه ی ساختار و فعالیت ژن ها از ای.کولای که یک پروکاریوتی است به عنوان میزبان استفاده می شود به طوری که حامل های ژنی متنوعی برای آن طراحی و ساخت شده است.

ناقل های ژن کلونینگ برای پروکاریوت ها

اما برای برخی از اهداف بیوتکنولوژی، نظیر خلق GMOها، استفاده از یک میزبان یوکاریوت ضرورت می یابد. با توجه به تفاوت های دستگاه های بیان ژن و ویرایش RNA که در سلول های پروکاریوتی ( شامل تمام باکتری ها) و یوکاریوتی(شامل سلول های گیاهی، جانوری و انواع آغازیان) وجود دارد بنابراین لازم است حامل های ژنی دیگری را به کار برد.

مخمر ساکرومایسس سروزیه، که مخمر مورد استفاده در تخمیر و نانوایی است، یکی از مهمترین موجودات در بیوتکنولوژی می باشد.

ساکاورومایسس سروزیه گونه ای مخمر جوانه ای است که دارای تکثیر غیر جنسی، به طریق جوانه زدن است. این مخمر از گذشته ی دور مفیدترین مخمر برای بشر بوده است چرا که در تخمیر خمیر نان و الکل سازی نقش اساسی دارد.

ناقل کلونینگ در پروکاریوت ها

امروزه این تک یاخته ی یوکاریوتی علاوه بر کاربرد سنتی  خود به عنوان یک میزبان یوکاریوتی برای تولید محصولات دارویی نوترکیب و پروتئین های یوکاریوتی از ژن های کلون شده اهمیت ویژه ای یافته است. لذا تلاش ها زیادی برای ساخت حاملین ژنی برای این مخمر صورت گرفته است.

با کشف پلاسمیدی به نام پلاسمید 2µm در مخمر، که از معدود پلاسمید های یافت شده در سلول های یوکاریوت است، پیشرفت در ساخت انواع ناقلین کلونینگ برای مخمر، تسریع شد.

پلاسمید 2µm که در اکثر سویه های ساکرومایسس سروزیه یافت می شود و 70 تا 200  نسخه از آن در سلول مخمر موجود می باشد در واقع خود اساس و منشا ساخت انواع ناقل های کلونینگ یوکاریوتی است.

پلاسمید 2µm به اندازه ی 6 کیلوباز می باشد که این اندازه برای یک حامل ژنی بسیار مطلوب می باشد. همانندسازی پلاسمید 2µm، برخلاف همانندسازی پلاسمیدهای باکتریایی، کاملاً تحت کنترل سیکل تقسیم  سلولی است و دستگاه پروئینی که این پلاسمید و کرومزوم های مخمر را همانندسازی می کند یکسان است و پروتئین های آن توسط ژن های هسته ای کد می شوند.

پلاسمید 2µm به طور کامل تعیین توالی و ژن های آن مشخص شده است. این پلاسمید دارای یک جایگاه شروع همانندسازی، و 4 ژن به نام ها REP1, REP2, FLP1 و D است. پروتئین حاصل از REP1, REP2 در تکثیر پلاسمید دخالت دارند و پروتئین کد شده توسط ژن FLP1 با ایجاد نوترکیبی درون مولکولی ترتیب ژنی را بازآرایی می کند.

با وجودی که اندازه ی کوچک این پلاسمید و همچنین فراوانیش در سلول های مخمر، آن را گزینه ی مناسبی برای کاربرد های مهندسی ژنتیک کرده است اما استفاده از آن چندان هم بی دردسر نیست. از جمله مشکلات پیش رو در کلونینگ ژن به وسیله ی پلاسمید 2µm حل مسئله ی نشانگر انتخابی است. چراکه وجود نشانگر انتخابی برای جداسازی یاخته های تراریخت از آنهایی که DNA نوترکیب را دریافت نکرده اند ضروری می باشد.

معمولاً برای حل مشکل گزینش تراریخت ها از میزبان هایی که در اثر جهش ژنتیکی توان ساخت یکی از آنزیم های دخیل در مسیر متابولیسمی اسیدآمینه ای را از دست داده اند استفاده می کنند. این میزبان را در اصطلاح «جهش یافته ی اگزوتروف» می گویند چرا که برای ادامه ی حیاتش لازم است که اسیدآمینه هایی که در مسیر متابولیسمی آنها نقص ایجاد شده است به محیط کِشتش اضافه شود.

با وارد کردن ژن سالم آنزیمی که در میزبان جهش یافته است به ناقل ژن می توان تراریخت ها را غربال کرد. به این ترتیب که با کشت سلول ها در «محیط کشت حداقل» (محیط فاقد هرگونه اسیدآمینه) تنها تراریخت ها، که از طریق DNA نوترکیب ژن سالم را دریافت کرده اند، قادر به ادامه ی حیات هستند و غیر تراریخت ها نابود می شوند.

 

 

نویسنده: سمانه سادات عنایتی

تنظیم برای تبیان: محسن مرادی

کلونینگ ژن(3)

بعد از تهیه و طراحی ناقل مناسب و اتصال ژن مورد نظر به آن، DNA نوترکیب باید وارد سلول زنده شود تا با استفاده از دستگاه همانندسازی موجود در سلول، ژن هدف تکثیر و بیان شود.

ناقل های ژن کلونینگ

در کلونینگ ژن برای انتقال ژن مورد نظر به سلول میزبان معمولاً لازم است که آن را وارد یک ناقل یا وکتور DNA ای کنند.

موجودات تراریخت(قسمت اول)

تراریخت یا ترنس ژنیک (Transgenic) سازی فرایندی است که طی آن موجودی با ویژگی های جدید ایجاد می شود.
,